دانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایلدانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایلبیان وتخلیص پروتئین نوترکیب DR2418 داینوکوکوس رادیودورانس در اشریشیا کلی
 بیان وتخلیص پروتئین نوترکیب DR2418 داینوکوکوس رادیودورانس در اشریشیا کلیفهرست عنوان صفحه فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده. 7 2-1- ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای:. 11 2-2- مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای:. 12 2-2-2- اتصال تک رشته (SSA):. 13 2-2-3- سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA): 13 2-4- پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما:. 15 2-5- ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه:. 16 2-6- منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی: 18 2-7- فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش. 20 2-7-1- پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش 21 2-7-2- پیامدهای بیوتکنولوژیکی اکستریمولیت های مقاوم در برابر اشعه. 27 2-8- محدودیتها و چالشها در دیدگاه پنج ساله. 30 3-1- آماده سازی وکتور pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیکdr2418-opti35 3-2- مستعدسازی E.coli DH5a. 35 3-3- تراریختی یا انتقال وکتور حاوی ژن سنتتیک به درون سلول مستعد E.coli DH5a. 36 3-3-1- استخراج پلاسمید pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک dr2418-opti37 3-3-2- تایید استخراج پلاسمید حاوی ژن سنتتیک با روش آگارز ژل الکتروفورز. 38 3-3-3- آماده سازی نمونهها برای الکتروفورز. 38 3-3-4- رنگ آمیزی DNA در ژل آگارز. 39 3-3-7- هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم NdeI40 3-3-8- هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم BamHI41 3-3-9- تخلیص ژن سنتتیک dr2418 از روی ژل. 41 3-3-10- برش پلاسمید pET-21a توسط آنزیم NdeI43 3-3-11- برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI43 3-3-12- لیگاسیون وکتور pET-21a و ژن سنتتیک dr2418. 44 3-3-13- ترنسفورماسیون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a 45 3-4- توالییابی ژن سنتتیک در pET-21a. 45 3-6- ارزیابی پروتئین DR2418 تولید شده به وسیله الکتروفورز در ژل پلی آکریلامید (SDS-PAGE)47 3-7- یکسان سازی غلظت کلی پروتئینها در نمونه های قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE. 50 3-8- شناسائی و تائید پروتئین His-tagged r-DR2418 با روش Western blot50 3-9- نگهداری و ذخیره باکتریهای مولد پروتئین ِDR2418: 52 3-10- بررسی پایداری پلاسمیدها (Plasmid stability Test). 53 3-11- خالصسازیپروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی 53 3-11-1- لیز سلولی باکتری E.coli54 3-11-3- تزریق نمونه و شستشو. 55 3-11-4- جدا سازی یپروتئین نوترکیب. 55 3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد. 56 3-11-5-2- تهیۀ محلول برادفورد. 57 3-11-6- بازیافت و نگهداری ستون. 57 4-1- غربال کردن کلنی های حاوی pGEM-B1 دارای قطعه DR2418: 59 4-2- غربال کردن کلنیهای E. coli DH5 حاوی pGEM-B1 دارای قطعه 59 4-2-1- تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI: 60 4-2-2- تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI:. 60 4-3- جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation:. 61 4-3-1- تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی: 63 4-5- شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش Western BlotWet transfer)). 64 4-6- بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت. 66 4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE:. 67 4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین:. 67 فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری69 فهرست شکل ها عنوان صفحه شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن.. 5 شکل 3. مسیرهای مختلف ترمیم DNA دورشته ای.. 12 شکل 4. مدل شماتیک از ارتباط حیات باکتری و پروتئین PprI و مسیرهای فعال شده... 17 شکل 5: ساختار شیمیایی سیتونمین.. 23 شکل 6: تولید سیتونمین در حضور تابش فرابنفش... 26 شکل 7. الکتروفورز پلاسمیدهای استخراج شده از کلنی های ترانسفورم شده با pGEM-B1 دارای قطعه... 59 شکل 8. هضم آنزیمی پلاسمیدهای pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک توسط آنزیم NdeI. 60 شکل 9. هضم آنزیمی پلاسمیدهای pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک خطی شده توسط آنزیم BamHI. 61 شکل 10. جداسازی قطعه ژن سنتتیک از روی ژل بمنظور تخلیص آن 62 شکل 11. لاین 1: وکتور pET 21a، لاین 2 تا 5: وکتور pET 21a حاوی ژن سنتتیک.. 62 شکل 12. نتایج همردیفی پلاسمید pET21a حاوی ژن مورد نظر (T7promoter) و ژن سنتز شده (Synthesized)... 63 شکل13. بررسی الگوی پروتئینی DR2418 بیان شده در E. coli Origami65 شکل14. شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش وسترن بلات 65 شکل15. تایید بیان پروتئین DR2418 در حجم یک لیتر محیط کشت با روش SDS-PAGE:.. 66 شکل16. برسی پروتئین DR2418 بعد از تخلیص از روی ستون کروماتوگرافی بر روی ژل SDS_PAGE.. 6 فهرست جداول و نمودارها عنوان صفحه جدول 1: محصولات متابولیکی میکروبی تولید شده ناشی از القاء پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی آنها... 20 جدول 2: نقش دارویی اکستریمولیت های جداسازی شده از اکستریموفیل های مقاوم به پرتو فرابنفش.. 24 چکیده زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد. روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با استفاده از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید. نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد. نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که پروتئین rDR2418 می تواند به عنوان یک کاندید مناسب پروتئین مقاوم به پرتو در نظر گرفته شود. بااین حال، خاصیت مقاومت به پرتو پروتئین DR2418 باید در سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی آنالیز شود. فصل اول:مقدمه و کلیاتمحیطهای دارای پرتوزایی جزء محیطهای خشن (Extreme) میباشند و در این محیطها میکروارگانیسمهای مقاوم به اشعههای رادیواکتیو در خانوادههای مختلف باکتریایی یافت میشوند. به عنوان مثال گونههای جنس Deinococcus حتی در دوزهای 25 KGy از خود مقاومت نشان میدهند که یکی از معروفترین گونههای متعلق به جنس Deinococcus و مقاوم به اشعه، Deinococcus radiodurans میباشد، بطوریکه این باکتری حتی در پرتوهای با دوز بالا به حیات خود ادامه میدهد. این باکتری جزء باکتریهای غیر بیماریزا است و میتوان آن را از محیطهای طبیعی جداسازی نمود و در محیطهای کشت آزمایشگاهی آن را کشت داد. مطالعات مختلفی در مورد مکانیسم مقاومت Deinococcus radiodurans به اشعه رادیواکتیو انجام شده است و مطالعات نشان میدهد که ژنهای کدکننده پروتئینهای دخیل در ایجاد مقاومت به اشعه در این باکتری وجود دارد ولی مکانیسم مولکولی آن هنوز بطور کامل مشخص نشده است. بااین حال مطالعات اخیر ژنهای مختلفی از قبیلDR2418، DR1709، pprI، RecXرا گزارش کردهاند که در ایجاد مقاومت به اشعه دارای نقش بسزایی میباشند و عملکرد آنها در زمینه از بین بردن رادیکالهای سمی اکسیژن و ترمیم DNAآسیب دیده میباشد. محیطهای خشن (Extreme) یکی از محیط های پرچالش برای ارگانیسم های زنده است. با این حال، تعداد زیادی از میکروارگانیسمهای متعلق به سه قلمرو حیات (باکتریها، یوکاریوتها و آرکیها) از محیطهای خشن مانند هیدروترمال و محیطهای خشک در معرض اشعه UV، محیط های بسیار گرم جداسازی شده اند. در میان این ارگانیسمهای مقاوم به شرایط خشن، باکتریهای متعلق به خانواده Deinococcaceae توانایی بسیار بالایی برای زیستن در محیط های در معرض اشعه های یونیزان دارند و Deinococcus radiodurans یکی از بهترین گونه هایی است مورد مطالعه قرار گرفته است. این باکتری توسط توانایی استثنایی اش در مقابله با اثرات تخریب کننده ساختار DNAاز جمله اشعه یونیزان، نور ماورای بنفش و شرایط خشکی مورد شناسایی قرار گرفته است. اشعههای یونیزان توسط تخریب عناصر
رادیواکتیو تولید می شود و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می
شود. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند
و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH.
توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد بطور مستقیم و
غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته
DNA را بوجود می آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از
عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA است و
تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E
, 2001).اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی
اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است که بیومولکول ها را از
آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل
اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن
به H2O تبدیل شود (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans
در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز
کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسمهای هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeriکد
می شود. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می شود (شکل
1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین
احیا شود که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR)
اکسیده می شود. در نهایت پراکسید به H2O توسط عملکرد روبرترین
تبدیل می شود. علاوه بر این، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای
بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید استفاده می کنند (تصویر
C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین
کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال
های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز. در این تحقیق در نظر است پروتئین DR2418 به صورت نوترکیب تهیه تا در تحقیقات آتی از آن استفاده شود. به طور خلاصه اهدف این تحقیق به شرح زیر است: _ باتوجهبهاینکهژنهایایجادکنندهمقاومتبهاشعهدرباکتری Deinococcus radiodurans وجوددارد،میتوانعملکرداینژنهارادرمقیاسآزمایشگاهیبررسینمود. بنابراینهدفازاینمطالعه،تهیةپروتئینیبودکهدرمقاومتباکترینسبتبهپرتونقشدارد. درتحقیقاتآتیمیتوانازآنبرایتهیةموادضدپرتواستفادهنمود. _ کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بیانی pET21 _ بررسی میزان بیان پروتئین DR2418در میزبانE.coli origami _ خالصسازیپروتئین نوترکیب DR2418به روش کروماتوگرافی |
بهینه سازی باکتریهای تولید کننده آنزیم l Asparginase در بستر جامد با استفاده از روش Resoponse surface methodology
 بهینه سازی باکتریهای تولید کننده آنزیم l Asparginase در بستر جامد با استفاده از روش Resoponse surface methodologyفهرست مطالب 1-4- تعریف اصطلاحات و واژگان تحقیق4 1-4-1- آنزیم ها و ساختار آن ها.. 4 1-4-2- مکانیسم عمل آنزیم ها.. 5 1-4-3- عوامل موثر بر فعالیت آنزیم ها.. 6 1-4-5- آنزیم های میکروبی و انواع آن ها.. 9 1-4-6- معرفی آنزیم ال-آسپارژیناز.. 10 1-4-7- منابع تولید آنزیم ال آسپارژیناز.. 11 1-4-8- مکانیسم عمل و ساختار آنزیم ال آسپارژیناز.. 13 1-4-9- خاک و میکروفلور آن.. 15 1-4-10- تخمیر در بستر جامد.. 16 1-4-10-1- سوبستراهای مورد استفاده برای تولید آنزیم در بستر جامد.. 17 فصل دوم:ادبیات و سوابق تحقیق19 فصل سوم:مواد و روش های تحقیق24 3-1- وسایل و تجهیزات به کار رفته در پژوهش25 3-2- جداسازی باکتری های مولد ال- آسپارژیناز از خاک27 3-2-1- مواد و محیط کشت های مورد استفاده برای جداسازی.. 27 3-3- شناسایی گونه های مولد آنزیم28 3-3-2-1- مراحل کلی شناسایی مولکولی29 3-3-2- بهینه سازی واکنش PCR29 3-3-3- انجام واکنش PCR بر روی نمونه های DNA ژنومی30 3-5- روش بهینه سازی و طراحی آزمایش32 3-5-1- طراحی آزمایش Plackett-Burman.. 32 3-5-2- بهینه سازی آماری تولید آنزیم آسپاراژیناز به روش RSM 34 3-8- روش انجام 12 آزمایش Burman- Plackett:38 3-8-1- مواد تشکیل دهنده محلول نمکی:.. 38 3-9- رسم منحنی استاندارد آمونیاک39 3-10- تهیه ی معرف های سنجش فعالیت آنزیم39 3-11- نحوه ی سنجش فعالیت آنزیم 12آزمایش40 3-11-1- تخمیر در بستر جامد طی بهینه سازی تولید با روش RSM: 41 3-11-2- اثر پارامترهای مختلف بر تولید آنزیم در بستر جامد 41 3-11-4- سنجش فعالیت آنزیم.. 42 3-13- اندازه گیری فعالیت آسپارژیناز از نظر کمی43 4-2- شناسایی گونه های مولد آنزیم45 4-2-1- شناسایی مولکولی46 4-3- اندازه گیری فعالیت آسپاراژیناز از نظر کمی48 4-5- طراحیآزمایشوبهینه سازیفرآیندبهروشسطحپاسخ50 4-5-2- بهینه سازی آماری تولید آسپاراژیناز در بستر جامد.. 51 4-5-4- نمودارهای سه بعدی تولید آنزیم در بستر جامد.. 55 فهرست جداول جدول1- 1- سویه های باکتریایی مولد ال آسپارژیناز12 جدول1- 2- اکتینومایست های مولد ال آسپارژیناز12 جدول3- 1- مواد به کار رفته در پژوهش26 جدول3- 2- مواد مورد استفاده در تهیه یک لیتر از محیط M927 جدول3-3- شرایط مختلف جهت بهینه سازی واکنش PCR30 جدول 3-4- ترکیب مواد برای تهیه مخلوطPCR31 جدول3- 5- سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman برای تخمیر در بستر جامد33 جدول3- 6- مقادیر حقیقی بر اساس طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman برای تخمیر در بستر جامد34 جدول3- 7- سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش به روش RSM برای تخمیر در بستر جامد36 جدول3- 8- مقادیر سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش یه روش RSM برای تخمیر در بستر جامد37 جدول3-9- جدول نشان دهنده مقادیر کد شده38 جدول4-1- خصوصیات بیوشیمیایی مربوط به باسیلوس جداسازی شده46 جدول4- 2- طراحی Plackett-Burman برای هشت متغیر کد شده با فعالیت آنزیم آسپاراژیناز49 جدول4- 4- مقادیر مشاهده شده آسپاراژیناز تولید شده در بسترذ جامد با استفاده از روش RSM. 51 جدول4- 5- آنالیز واریانس (ANOVA) برای مدل مربع سطح پاسخ در بستر جامد 53 فهرست نمودارها نمودار3- 1- منحنی استاندارد ترسیم شده برای سنجش فعالیت آنزیمی39 نمودار4- 2- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل میزان منبع کربن و دما56 نمودار4- 4- طراحی سطح پاسخ تاثیر متقابل منبع نیتروژن و دما در تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد58 نمودار4- 6- طراحی سطح پاسخ تاثیردما و زمان انکوباسیون در تولید تولید آنزیم آسپاراژیناز در بستر جامد60 فهرست اشکال شکل1- 2- نمای شماتیک و جزئی تر از مکانیسم احتمالی عمل در ال آسپارژیناز15 شکل 3-1- برنامه دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیرتوالی مورد نظر.............................................................31 شکل3- 2- نشان دهنده لوله های حاوی محلول نهایی مورد آزمایش یا test group است.41 شکل3- 3- نشان دهنده استخراج آنزیم ال آسپارژیناز با بهره گیری از کاغذ صافی است.43 شکل4- 2- باکتری های جداشده در محیط کشت 9 M. 45 شکل4-4- آنالیز کیفی استخراج ژنومی باکتری بر روی ژل آگاروز 1%.......................................................47 شکل-4-5 نتایج بلاست 13 باکتری تولید کننده آسپارژیناز.........................................................................48 شکل4- 6- انطباق بین مقدار تجربی و مقدار پیش بینی شده در بستر جامد54 چکیدهدر این تحقیق روش تخمیر در بستر جامد به منظور تولید آسپارژیناز توسط سویه جداسازی شده از جنس باسیلوس با استفاده از سبوس برنج انجام گردید.بررسی اولیه با استفاده از طراحی Plackett-Burman نشان داد که از میان منابع کربن مورد آزمایش شامل: سبوس برنج، سبوس گندم، ساقه برنج، ساقه گندم ،سبوس برنج بهترین تأثیر را در افزایش تولید آنزیم واز میان منابع نیتروژن مورد آزمایش شامل: آسپاراژین، عصاره مخمر، پپتون ، تریپتون، آسپاراژین بهترین تأثیر در افزایش تولید آسپارژیناز را در بستر جامد نشان دادند(05/0>p). در مرحله بعدی بهینه سازی طی بررسی4فاکتور سبوس برنج، آسپارژین، دمای انکوباسیون، زمان انکوباسیون در 5 سطح بر تولید آسپارژینازبا بکار گیری روش RSM مقدار تولید آنزیم U/g24/69 حاصل شد. در بستر جامد میزان تولید آنزیم در مقایسه با بکارگیری طراحی آزمایش به روش Plackett-Burman و RSM 3 برابر حاصل شد. همچنین تحقیقات برای تعیین ویژگی های آنزیم آسپارژیناز تولید شده توسط سویه باکتریایی جداسازی شده انجام پذیرفت. حداکثر میزان تولید آنزیم تجربی بدست آمده در بستر جامد در میزان غلظت سبوس برنج5/1 درصد وزنی-وزنی، میزان غلظت آسپاراژین 5/0 درصد وزنی-وزنی، دمای 30 درجه سانتی گراد، و مدت زمان 72 ساعت بود.نتایج حاکی از اهمیت تولید آسپارژیناز در بستر جامد با استفاده از سوبسترای ضایعات سبوس برنج به دلیل قیمت ارزان و قابلیت دسترسی فراوان و پتانسیل بالا در تولید آنزیم است. کلمات کلیدی: بهینه سازی، ضایعات سبوس برنج، تخمیر در بستر جامد فصل اول:کلیات پژوهشمقدمه:آنزیم ها مواد پروتئینی هستند که توسط همه موجودات زنده ساخته می شوند و کاتالیز واکنش های شیمیایی را در سلول به عهده دارند. آنزیم ال آسپارژیناز هیدرولیز آسپارژین را به آسپارتیک اسید بر عهده دارد و توسط انواع مختلف سلول ها به ویژه میکروارگانیسم ها تولید می شود. آنزیم آسپارژیناز کاربردهای مختلف صنعتی و دارویی متعددی دارد. آسپارژیناز به عنوان ماده افزودنی به مواد غذایی افزوده می شود و جلوی سنتز اکریلامید که یک ماده کارسینوژن است را می گیرد. شناسایی آسپارژیناز به عنوان داروی ضد سرطان به سال 1953 میلادی و هنگامی که دانشمندان در موش و رت مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد سرم خوک را تزریق کردند و مشاهده شد که پیشرفت بیماری کنترل شد ، باز می گردد . بعدها مشخص شد که این خود سرم به تنهایی نبود که باعث مهار تومور شده است بلکه آنزیم ال آسپارژیناز در مهار تومور موثر بوده است. بعد از انجام تحقیقات گسترده مشخص شد که آسپارژیناز به دست آمده E.coli و Erwinia بهترین نوع داروی ضد سرطان است. آسپارژیناز هم چنین به عنوان دارو با نام تجاری ال آسپار برای درمان لوسمی حاد لنفوبلاستیک به کار می رود. بر خلاف سایر داروهای مورد استفاده در درمان لوسمی حاد لنفوبلاستیک، آسپارژیناز را می توان به صورت درون عضلانی و داخل وریدی بدون ترس از تحریک بافت به کار برد.در این پژوهش به بررسی تولید آنزیم ال آسپارژیناز در باکتری های جدا شده از خاک و بررسی فعالیت آنزیمی آن ها به روش RSM پرداخته شده است. 1-1- اهداف پژوهش1- جداسازی باکتری های تولید کننده آنزیم ال آسپارژیناز 2- تاثیر فاکتورهای موثر محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت بر روی تولید آنزیم 3- بدست آوردن شرایط بهینه تولید آنزیم از باکتری ایزوله شده با استفاده از روش Response surface method 1-2- فرضیه های پژوهش1- تغییر فاکتورهای محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت درافزایش تولید آنزیم ال آسپارژیناز تاثیر دارد. 2- با استفاده از روش Response surface method می توان به شرایط بهینه تولید آنزیم دست یافت. 1-3- پرسش های پژوهش1-از بین باکتری های جداسازی شده کدامیک توانایی بیشتری در تولید آنزیم ال آسپارژیناز دارند؟ 2-آیا تغییر فاکتورهای محیطی و اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت درافزایش تولید آنزیم ال آسپارژیناز تاثیر دارد؟ 3-آیا با استفاده از روش Response surface method می توان به شرایط بهینه تولید آنزیم دست یافت؟ 1-4- تعریف اصطلاحات و واژگان تحقیق1-4-1- آنزیم ها و ساختار آن هاآنزیم ها موادی پروتئینی هستند که توسط سلول ها تولید شده و به عنوان کاتالیست جهت سرعت بخشیدن به این واکنش های شیمیایی که در سلول رخ می دهند، عمل می کنند. آنزیم ها می توانند سرعت واکنش های سلول را تا 106تا 1012 افزایش داده و این امکان را ایجاد کنند که واکنش ها در دمای عادی سلول انجام بگیرد. کار یک آنزیم این است که ساختار مولکول مورد نظر را تغییر می دهد که این تغییر می تواند اضافه کردن یک اتم به مولکول، شکافتن یک مولکول به دو مولکول کوچک تر یا به هم پیوند دادن دو یا چند مولکول کوچک برای ایجاد یک مولکول بزرگ تر باشد اما حقیقت اصلی و ثابت این است که آنزیم همواره سبب ایجاد تغییری گذرا در ماده مورد نظر می شود. [1] آنزیم ها همانند سایر پروتئین ها از آمینو اسیدها تشکیل شده اند اما از لحاظ عملکرد با آن ها متفاوت اند و این توانایی را دارند که بدون این که ساختار خودشان دچار تغییر بشود در واکنش های شیمیایی را تسهیل کنند. همانطور که اشاره شد آنزیم ها از به هم پیوستن واحدهای آمینو اسید توسط پیوند پپتیدی به هم ایجاد شده اند. آنزیم ها را می توان با نمک ها، حلال ها و سایر واکنشگرها رسوب داد یا دناتوره کرد. وزن مولکولی آنزیم ها از 10000 تا 2000000 متغیر است. بسیاری از آنزیم ها برای فعالیت خود نیاز به حضور یک ماده به نام کوفاکتور دارند. به کل ساختار فعال آنزیم هولو آنزیم گفته می شود که شامل اپوآنزیم( جزء پروتئینی)+ کوفاکتور( کوآنزیم، گروه پروستتیک یا یون فلزی فعال کننده ) است.[2] 1-4-2- مکانیسم عمل آنزیم هابر اساس استدلال فیشر بسیاری از آنزیم ها به هنگام تشخیص کمپلکس آنزیم-سوبسترا مانند روشی که یک کلید با قفل جفت می شود عمل می کنند. به چنین قفل آنزیمی، جایگاه فعال گفته می شود. در بیشتر آنزیم ها، جایگاه فعال بر روی سطح آنزیم، شکلی شبیه به یک شکاف یا جیب را به خود می گیرد . وظیفه جایگاه فعال علاوه بر شناسایی سوبسترا، فراهم آوردن فضایی سه بعدی برای محافظت سوبسترا در برابر حلال و نیز تسهیل کاتالیز واکنش است. [1] آنزیم ها به منظور تسهیل روند واکنش مکانیسم های متعددی را مورد استفاده قرار می دهند ولی به طور کلی ترکیب های مختلفی از چهار نوع مکانیسم عمومی، سبب ایجاد توانایی کاتالیزوری در آنزیم و افزایش سرعت واکنش است: الف) کاتالیز واکنش از راه مجاورت: مولکول ها برای این که بتوانند با هم واکنش بدهند باید تا حد تشکیل پیوند به هم نزدیک گردند و هر چه غلظت مولکول ها بیشتر باشد احتمال برخورد و بنابراین سرعت واکنش افزایش می یابد. هنگام برقراری اتصال بین آنزیم و سوبسترا در جایگاه فعال، ناحیه ای موضعی با غلظت بالای سوبسترا به وجود می آید. این محیط باعث فراهم شدن جهت مطلوب قرارگیری برای مولکول های سوبسترا و افزایش سرعت واکنش می شود.[3] ب)کاتالیز اسید-باز گروه های فعال با قابلیت یونیزه شدن در زنجیره جانبی اسیدهای آمینه و یا گروه های پروستتیک، از راه خاصیت اسیدی یا بازی در فرایند کاتالیز شرکت می کنند. این نوع کاتالیز می تواند به صورت عمومی یا اختصاصی انجام شود. در نوع اختصاصی سرعت واکنش به تغییرات غلظت پروتون ها حساسیت دارد و به غلظت سایر اسیدها یا بازها ارتباطی ندارد. سرعت واکنش های عمومی به تغییرات همه اسیدها یا بازهای موجود در محیط بستگی دارند. [4] ج)کاتالیز کششی در واکنش های لیتیک آنزیم های مربوطه به نحوی به سوبسترای خود وصل می شوند و با ایجاد نوعی حالت گذار،شکل فضایی پیوندی که باید شکسته بشود را تاحدودی نامطلوب می سازند. به این صورت کشش ایجاد شده پیوند مذکور را سست کرده و آن را برای شکستن مستعد می سازد. [5] د)کاتالیز کوالانسی در این نوع فرایند میان آنزیم و یک یا چند سوبسترا پیوند کوالانسی به وجود می آید و آنزیمی که به این صورت تغییر پیدا کرده وارد واکنش می شود. این نوع کاتالیز واکنش را از مسیری با انرژی فعال سازی کمتر و در نتیجه سرعت بیشتر هدایت می کند و بعد از انجام واکنش آنزیم دوباره به حالت اول خود باز می گردد.[4] 1-4-3- عوامل موثر بر فعالیت آنزیم هاداشتن اطلاعات پایه در رابطه با تئوری کینتیک در تحلیل و شناسایی آنزیم ها هم برای درک مکانیسم پایه ای آنزیمی و هم برای انتخاب روش مناسب در سنجش فعالیت آنزیم موثر و مفید است. شرایطی که برای ارزیابی فعالیت یک آنزیم در نظر گرفته می شود با شرایط مورد نظر درمورد ارزیابی غلظت سوبسترا مانند هم نیستند. عوامل متعددی وجود دارند که واکنش آنزیمی را تحت تاثیر قرار می دهند مانند، دما، pH ، غلظت آنزیم، غلظت سوبسترا و حضور بازدارنده ها و فعال کننده ها. [3] الف)تاثیر دما بر واکنش های آنزیمی مانند سایر واکنش های شیمیایی، نسبت واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم با افزایش دما افزایش پیدا می کند. افزایش دما تا 10 درجه سانتی گراد باعث افزایش فعالیت آنزیم به میزان 50 تا 100% می شود. در برخی از واکنش های آنزیمی افزایش دما تاثیر معکوس روی واکنش دارد. البته دمای بالای 40 درجه نیز برای عملکرد اکثر آنزیم ها مناسب نیست و باعث دناتوره شدن یا غیرفعال شدن آن ها می شود. اکثر آنزیم ها در شرایط آزمایشگاهی در دمای 5 درجه سانتی گراد نگه داری می شوند و یخ زدگی باعث از دست رفتن فعالیت در برخی از آنزیم ها می شود. [4] ب) تاثیر pH آنزیم ها تحت تاثیر تغییرات pH قرار می گیرند. مناسب ترین میزان pH که در آن آنزیم بیشترین فعالیت را دارد pH اپتیمم یا بهینه نام دارد. میزان خیلی بالا یا پایین pH منجر به از دست رفتن فعالیت آنزیمی می شود. هم چنین pH یکی از عوامل موثر در ثبات و پایداری آنزیم به شمار می آید. آنزیم ها دارای محدوده ای از pH بهینه برای ثبات خود هستند. ج)غلظت آنزیم برای بررسی تاثیر غلظت بالای آنزیم در سرعت واکنش، سوبسترا باید در مقدار زیاد حضور داشته باشد به عنوان مثال واکنش باید مستقل از غلظت سوبسترا باشد. به این ترتیب هر تغییری در میزان محصول تولید شده با میزان حضور آنزیم مرتبط خواهد بود. به این نوع واکنش ها "zero order" گفته می شود چون سرعت آن ها مستقل از غلظت سوبسترا و برابر با ثابت K است. [5] د) غلظت سوبسترا از لحاظ تجربی نشان داده شده است که اگر مقدار آنزیم ثابت نگه داشته شود غلظت سوبسترا تدریجا افزایش می یابد و شدت واکنش تا رسیدن به یک مقدار بیشینه افزایش می یابد. بعد از این مرحله با افزایش میزان سوبسترا شدت واکنش افزایش پیدا نخواهد کرد. د)تاثیر بازدارنده ها بازدارنده های آنزیمی موادی هستند که عملکرد کاتالتیک آنزیم را تحت تاثیر قرار می دهند و در نهایت باعث کاهش سرعت یا توقف واکنش می شوند. سه نوع بازدارنده آنزیمی متداول وجود دارد: بازدارنده رقابتی، غیررقابتی و بازدارنده سوبسترا. [6] 1-4-4- انواع آنزیمآنزیم ها معمولا بر اساس ترکیباتی که روی آن ها اثر می کنند نام گذاری می شوند.برخی از مهم ترین آن ها مانند لیپاز که روی چربی ها اثر می کند و باعث شکسته شدن آن ها به اسید چرب و گلیسرول می شود، پروتئازها که پروتئین ها را به زنجیره های پلی پپتیدی و در نهایت ساختارهای پپتیدی کوچک و آمینو اسیدها می شکند، آمیلاز که نشاسته را به قندهای ساده تر مانند آمیلوز می شکند یا سلولاز که سلولز را به واحدهای گلوکز تبدیل می کند.[7] نوع دیگری از طبقه بندی آنزیم ها بر اساس واکنش هایی است که کاتالیز می کنند: 1.اضافه کردن یا حذف آب الف)هیدرولازها مانند استراز ها، کربوهیدرازها، نوکلئازها، دآمینازها، آمیدازها و پروتئاز ها ب)هیدرازها مانند فوماراز، انولاز، آکونیتاز و کربنیک انهیدراز 2)انتقال الکترون الف) اکسیدازها ب) دهیدروژنازها 3) انتقال گروه الف)ترانس گلیکوزیداز ب)ترانس فسفوریلاز و فسفوموتازها ج) ترانس آمیناز د) ترانس متیلاز ه) ترانس استیلاز 4) ایجاد یا شکستن پیوندهای کربن-کربن الف) دسمولازها 5) تغییر شکل هندسی یا ساختار مولکول الف) ایزومرازها 6) پیوستن دو مولکول به هم از طریق هیدرولیز ATP یا سایر مولکول های تری فسفات الف) لیگاز ها[5] 1-4-5- آنزیم های میکروبی و انواع آن هاآنزیم ها در همه سلول های زنده و بنابراین در همه میکروارگانیسم ها حضور دارند. هر میکروارگانیسم تعداد زیادی آنزیم هیدرولیز کننده، اکسید یا احیا کننده و متابولیک را برای خود در طبیعت تولید می کند. اما میزان مطلق و نسبی هر یک از این آنزیم های تولید شده بین گونه های مختلف و حتی بین سوش های مختلف یک گونه متفاوت است. بنابراین طبیعی است که سویه ای را برای تولید آنزیم در مقیاس صنعتی و تجاری انتخاب کنیم که میزان بیشتری از آنزیم مورد نظر ما را تولید می کند. آنزیم های تجاری و صنعتی بیشتر از کپک ها، باکتری ها و مخمرها تولید می شوند. [8] آنزیم های میکروارگانیسم ها نسبت به آنزیم های گیاهی و جانوری در استفاده صنعتی و تجاری برتری دارند زیرا، دسترسی به آنها آسان تر است، افزایش بازده تولید در فرایند میکروبی ساده تر از فرایند های گیاهی و جانوری است، از لحاظ اقتصادی تولیدشان مقرون به صرفه است، امکان دستکاری های ژنتیکی بر روی آن ها نسبت به آنزیم های گیاهی و جانوری بیشتر است، به علاوه تنوع فعالیت کاتالتیک آن ها بیشتر است. در محدوده وسیعی از pH فعال هستند، در عین حال با استفاده از فناوری DNAنوترکیب می توان آنزیم های با منشا جانوری را با بهره گیری از میکروارگانیسم ها تولید کرد. آنزیم های میکروبی به دلیل داشتن چنین ویژگی هایی توجه محققین را به سوی خود جلب کرده اند.[7] تا ده سال پیش آنزیم های صنعتی باکتریایی و قارچی با روش کشت سطحی به دست می آمدند که هم اکنون روش های کشت Submerged به صورت گسترده مورد استفاده قرار می گیرند. اما زمانی که استفاده از آنزیم های میکروبی در مقاصد درمانی مد نظر است بعضی مسائل قابلیت استفاده آن ها را پایین می آورد. یکی از مهم ترین این مشکلات اندازه مولکولی بزرگ بیوکاتالیست هاست که از توزیع آن ها در سلول سوماتیک جلوگیری می کند. مشکل دیگر برانگیخته شدن پاسخ ایمنی سلول میزبان بعد از تزریق و ورود پروتئین بیگانه است. البته دانش مدرن امروز با با تغییرات کوالانسی می تواند آنزیم را با یک ماده غیر پروتئینی دیگر احاطه کند و بر این مشکل غلبه نماید. برخی از آنزیم های مهم میکروبی که در مقاصد درمانی مورد استفاده قرار می گیرند به شرح زیر هستند: ال-آسپارژیناز: خاصیت ضد توموری، ال گلوتامیناز: خاصیت ضد توموری، سوپراکسید دیسموتاز: آنتی اکسیدان وضد التهاب، سراتیو پپتیداز: ضد التهاب، پنی سیلین آسیلاز: سنتز صنعتی آنتی بیوتیک، کلاژناز: درمان ضایعات پوستی، لیپاز: تجزیه زیستی لیپیدها، استرپتوکیناز: ضد انعقاد، یوروکیناز: ضد انعقاد، لاکاز: سم زدا، ال آرژیناز: ضد تومور، ریبونوکلئاز: ضد ویروس.[9] 1-4-6- معرفی آنزیم ال-آسپارژینازآنزیم ال آسپارژیناز، در صنعت رو به رشد استفاده از آنزیم های میکروبی اخیرا توانسته است از جایگاه مناسبی برخوردار بشود که این به دلیل پتانسیل آنزیم مذکور برای استفاده در درمان لنفوبلاستوماهای بدخیم به ویژه لوسمی لنفوبلاستیک حاد و لنفوسارکوما و نیز استفاده در صنایع غذایی برای جلوگیری از تشکیل اکریلامیدها در مواد غذایی سرخ شده در حرارت بالا است. این آنزیم گزینه ای برای درمان لنفومای غیر هوچکین، کارسینومای پانکراتیک ، لنفوسارکومای گاوی نیز هست همین خاصیت ضد سرطانی باعث شده تا توجه محققین بیش از پیش به سمت آن معطوف گردد. عملکرد ضد سرطانی این آنزیم مربوط به احیا ال-آسپارژین است و دلیل این امر در ناتوانی سلول های توموری در سنتز آسپارژین است که به این ترتیب به صورت انتخابی فقط سلول های توموری کشته می شوند. [10] این آنزیم اولین بار در سال 1953 و با کشف این مسئله که عامل ضد لنفوما در سرم خوک های گینه ای ال آسپارژیناز بوده است نظر دانشمندان را به خود جلب کرد.[11] آنزیم ال آسپارژیناز واکنش تبدیل ال آسپارژین را به ال آسپارتیک اسید و آمونیاک کاتالیز می کند. سمیت انتخابی روی سلول های لوسمیک بدون تاثیر گذاشتن روی سلول های سالم به دلیل کاهش موثر سطح ال آسپارژین در پلاسما در بدن ایجاد می شود که منجر به جلوگیری از سنتز پروتئین و در نهایت توقف سنتز DNAو RNA می شود که القا آپوپتوز در سلول مبتلا به لوسمی را در پی خواهد داشت. سلول های توموری نیازمند به دست آوردن آمینو اسید ال آسپارژین از مایعات بدن نیاز دارند. از آن جایی که برخی از سلول های مبتلا به لوسمی به طور کامل با سلول های طبیعی متفاوت هستند، قادر به ساختن آسپارژین سنتتاز نیستند و به طور کامل به ال آسپارژین اگزوژن وابسته هستند[12] ال آسپارژیناز جایگزین مناسبی برای روش های متداول و استاندارد شیمی درمانی در این زمینه به حساب می آید. به کارگیری چنین پروتئین های آنزیمی برای مدت طولانی، باعث تولید آنتی بادی مشابه در بافت ها در نتیجه شوک آنافیلاکتیک یا خنثی سازی تاثیر دارو می شود، بنابراین استفاده از ال آسپارژیناز جدید سرولوژیک با تاثیرات درمانی مشابه به شدت مطلوب است.[13] در بیشتر میکروارگانیسم ها ال آسپارژیناز به صورت یک محصول داخل سلولی هم در فضای پریپلاسمی و هم در سیتوپلاسم تجمع می یابد. آنزیم ال آسپارژیناز علاوه بر خاصیت ضد سرطانی تاثیرات شدید ایمونو ساپرسیو در شرایط in vivo و in vitro دارد.[14] 1-4-7- منابع تولید آنزیم ال آسپارژینازآنزیم ال آسپارژیناز در بسیاری از بافت های جانوری، گیاهی و باکتری ها و در سرم گروه های خاصی از جوندگان یافت می شود ولی در انسان وجود ندارد. باکتری های متعددی قادر به تولید ال آسپارژیناز هستند که به مهم ترین آن ها در جدول زیر اشاره شده است جدول1- 1- سویه های باکتریایی مولد ال آسپارژیناز
جدول1- 2- اکتینومایست های مولد ال آسپارژیناز
در میان مخمر ها ساکارومیسس سرویزیه قادر به تولید آنزیم ال آسپارژیناز می باشد علاوه بر این گونه های قارچی مانند Aspergillus tereus وAspergillus tamariو برخی دیگر از قارچ های رشته ای نیز مولد این آنزیم هستند.[15] باکتری E.coli دو نوع ال آسپارژیناز تولید می کند: ال آسپارژیناز I که در سیتوپلاسم یافت می شود و ال آسپارژیناز II که در فضای پریپلاسمی وجود دارد. این دو نوع آنزیم از لحاظ شرایطی که در آن ساخته می شوند با هم متفاوت هستند. ال آسپارژیناز I به صورت پیوسته سنتز می شود و ال آسپارژیناز II تحت شرایط بی هوازی و محیط های با تراکم بالای آمینو اسید و حضور مقادیر ناچیز یا به طور کلی غیاب قندها ساخته می شود. بنابراین وقتی باکتری به صورت هوازی در محیط حاوی گلوکز رشد می کند فقط آنزیم سیتوپلاسمی را تولید می کند. این آنزیم به E.coli اجازه می دهد تا ال آسپارژیناز را به عنوان منبع خالص نیتروژن استفاده کند.[16] آنزیم ال آسپارژیناز II در E.coli یا EcAII تمایل شدیدی به پیوند با سوبسترا دارد و Km آن برابر با 1-4-8- مکانیسم عمل و ساختار آنزیم ال آسپارژینازساختار کریستالی آنزیم ال آسپارژیناز در E.coli و ، Erwinia carotovora مورد شناسایی و بررسی قرار گرفته است. هر دوی این آنزیم ها به صورت هموتترامر فعال هستند؛ هر دوی این آنزیم ها دارای چهار زیر واحد مشخص 326 واحدی هستند. در هر یک از چهار جایگاه فعال یک مولکول محصول واکنش ال آسپارژین متصل شده است که تعیین کننده تقابل میان آنزیم و سوبسترا است. تترامر آنزیمی از یک جفت دایمر و یک رابط دایمری بزرگ تشکیل شده است. دایمرهای این تترامر را با عنوان دایمرهای نزدیک به هم توصیف کرد. هر کدام از این دایمرهای نزدیک به هم دارای دو جایگاه فعال هستند و هر جایگاه فعال دارای بخشی از بقایای هر دو مونومر در دایمرهای نزدیک به هم است. در E.coliساختار کریستالی حاوی چهار مولکول ال آسپارتات است، که هر یک به یک جایگاه فعال متصل هستند.[18] گرچه دایمرهای نزدیک به هم برای تشکیل جایگاه فعال ضروری هستند، اما این واکنش ها اکثرا در درون یک زیر واحد شکل می گیرند و دو بنیان ترئونین(ترئونین 12 و ترئونین89) در آن دخالت دارند، که مقابل هر دو طرف زنجیره جانبی مولکول لیگاند قرار دارند. از آن جایی که هر دو بنیان ترئونین برای فعالیت ضروری هستند برای مدت های طولانی این سئوال مطرح بود که کدام یک از آن ها OHنوکلئوفیل را برای حمله به اتم کربن پیوند آمیدی به کار می برندکه البته به نظر می رسد ترئونین 12 این نقش را بر عهده داشته باشد.[19،17] مکانیسم عمل آنزیم ال آسپارژیناز دقیقا مشخص نشده است اما هیدرولیز طی دو مرحله و از طریق تشکیل واسطه بتا-آسیل آنزیم پیشرفت می کند. شکل زیر نمای شماتیکی از مکانیسم عمل احتمالی آنزیم را به نمایش می گذارد: شکل1- 1- تصویر شماتیک مکانیسم عمل آنزیم ال آسپارژیناز، واسطه کوالانسی مورد نظر از طریق حمله مزوفیلی توسط آنزیم شکل می گیرد.[20] به طور کلی مکانیسم عملکرد در ال آسپارژیناز با سرین پروتئازهای کلاسیک قابل مقایسه است که فعالیت در آن ها به حضور یک سری از بنیان های اسید آمینه به صورت معمول Ser-His-Asp که با عنوان مثلث کاتالتیک از آن یاد می شود بستگی دارد.[21] این مجموعه دارای یک بنیان نوکلئوفیل (Ser) یک باز عمومی (His) و یک بنیان اسیدی (Asp) است که همگی توسط یک زنجیره از پیوندهای هیدروژنی به هم متصل شده اند. واکنش در دو مرحله پیشرفت می کند. مرحله اول بخش نوکلئوفیل آنزیم از طریق یک پیوند O-H… قوی به یک بنیان بازی جایگزین متصل شده و به یک اتم کربن از بخش آمیدی سوبسترا حمله می کند که به یک حالت گذار از تتراهدرال به یک واسطه آسیل منجر می شود. بار منفی روی اتم اکسیژن گروه آمید در حالت گذار با یک دهنده پروتون مجاور تثبیت می شود. مجموعه این دهنده ها به عنوان مجرای اکس آنیون شناخته می شوند. مرحله دوم نیز مشابه مرحله اول است اما در این جا حمله به اتم کربن استری با یک مولکول آب فعال شده نوکلئوفیل صورت می گیرد. [22] شکل1- 2- نمای شماتیک و جزئی تر از مکانیسم احتمالی عمل در ال آسپارژیناز [18] 1-4-9- خاک و میکروفلور آنخاک یک تشکیلات پیچیده است که اکوسیستم خاک را شکل می دهد. ترکیب کلی خاک شامل مواد معدنی،موجودات زنده، هوا و مواد محلول است. خاک در تشکیل بیومس اولیه نقش دارد و گیاهان را در خود جای داده است و آب و مواد معدنی لازم را در اختیار آن ها می گذارد. فرایند تجزیه مواد آلی و تجمع و تشکیل هوموس در خاک رخ می دهد. خاک بر اساس ترکیب شیمیایی و ویژگی های فیزیکی اش زیستگاه مناسبی برای میکروارگانیسم ها و سایر موجودات زنده تشکیل می دهد. موجودات زنده خاک را بر اساس اندازه به سه گروه می توان تقسیم کرد که ترکیب آن ها بسته به نوع محیط اطرافشان متفاوت است: میکروبیوتا: موجودات در اصطلاح ذره بینی که با چشم غیر مسلح قابل رویت نیستند مانند، ویروس ها، باکتری ها، قارچ های میکروسکوپی، پروتوزواها و جلبک ها مزوبیوتا: 0.2-2 mm)) شامل نماتودها، مایت ها، میراپدها، حشرات بدون بال، حلزون ها و برخی گیاهان ریز ماکروبیوتا: (>2 mm) کرم های خاکی، حشرات بزرگ تر، جوندگانی مانند موش و ریشه گیاهان بزرگ .[23] به طور کلی میکرو بیوتا یا همان میکروفلور خاک نقش مهمی را برعهده دارد . یکی از عمده ترین فعالیت های میکروفلور خاک مشارکت در تجزیه و تغییرات زیستی مواد آلی است. میکروارگانیسم ها می توانند با هم زیستی با گیاهان یا جلبک ها تثبیت نیتروژن انجام داده و همینطور باعث بهبود بافت خاک و نیز اکسیژن رسانی به آن بشوند.هم چنین متابولیت های تولید شده توسط این میکروارگانیسم ها از اهمیت بسزایی در پزشکی، داروسازی، صنایع غذایی و ... برخوردار است.[23] در این پژوهش به جداسازی باکتری های مولد ال آسپارژیناز از خاک و نیز سنجش فعالیت آنزیمی آن به روش RSM پرداخته شده است. 1-4-10- تخمیر در بستر جامداز چنین هزارسال پیش تا کنون در آسیا از تخمیر بر روی بست جامد بر روی تولید غذا های تخمیری متنوعی استفاده شده است ولی این روش به ندرت در اروپا و آمریکای شمالی به کار می رود. این روش از طریق رشد میکروارگانیسم بر روی مواد جامد که معمولا ترکیبات آلی و فاقد آب آزاد می باشد صورت می گیرد.بستر های مورد استفاده اغلب غلات ،سبوس،بقولات و مواد سلولوزی مثل کاه و خرده چوب و ... می باشد. فرایندهای سنتی عمدتا برای تولید غذاهای تخمیری مثل تمپه و سوفوی شرقی ،پنیرها،قارچ های خوراکی ،کمپوست و موادسیلویی به کار می روند.بعلاوه امروزه آنزیم ها ،اسید های آلی از طریق تخمیر در بستر جامد تولید می شوند.[24] فرایند های تخمیر در بستر جامد فاقد مکانیسم های کنترل پیشرفته ای هستنذ که در تخمیر غوطه ور وجود دارد می باشند.اغلب این تخمیرها به دلیل فقدان آگاهی از کنتیک رشد میکروبی تحت چنین شرایطی استفاده نمی شوند.کنترل محیط درون بیورآکتوربخصوص حفظ همزمان درجه حرارت و رطوبت نیز دشوار است.البته در بعضی موارد تخمیردر بستر جامد مناسب ترین روش برای تولید فرآورده های خاص می باشد.به عنوان مثال برخی قارچ ها درتخمیرهای غوطه ور تشگیل اسپور نمی دهندولی در تخمیر بر روی بستر جامد اسپور تشکیل می شود. این روش به طور موفقیت آمیزدر تولید اسپورهایContiothyrium minitans برای کنترل بیولوژیکی قارچ بیماری زای گیاهی Slcerotinia sclerotiorum به کار می رود. تخمیر در بستر جامد فرایندی چند مرحله ای می باشد که شامل : 1-پیش تیمار بستر 2-هیدرولیز بستر های پلی مری مثل پلی ساکارید ها و پروتـین ها 3-مصرف فرآورده های هیدرولیز شده 4-جدا سازی و تصفیه فرآورده های نهایی میکروارگانیسم های به کار رفته در تخمیرهای بستر جامدمیکروارگانیسم هایی هستند که فعالیت آبی نسبتأ پایین 7/0aw= را تحمل می کنند[24] 1-4-10-1- سوبستراهای مورد استفاده برای تولید آنزیم در بستر جامددر سیستم تخمیر به روش جامد، ضایعات کشاورزی به عنوان بهترین سوبسترا مطرح هستند. از سوبستراهای مختلفی برای کشت میکروارگانیسم ها جهت تولید آنزیم به کار گرفته شده اند. بعضی از سوبستراها شامل تفاله نیشکر، کاه گندم، کاه برنج، پوست ذرت، پوست گندم، پوست برنج، پوست نخود، سبوس برنج، پوست سویا، ضایعات مو انگور، خاک اره، چوب ذرت، الیاف نارگیل، ضایعات چای، تفاله نیشکر چغندر، روغن کیک نارگیل، آرد گندم، آرد ذرت و ....هستند. انتخاب سوبسترا برای تولید آنزیم در فرایند تخمیر در بستر جامد وابسته به فاکتورهای متعدداز قبیل قیمت و قابلیت دسترسی سوبسترا است.[25] در فرایند تخمیر در بستر جامد،سوبسترا جامد نه تنها به عنوان ماده غذایی برای رشد میکروب است بلکه به عنوان جایگاهی برای اتصال سلول است.سوبسترایی که تمام نیاز های غذایی مورد نیاز میکروارگانیسم ها را برای رشد فراهم میکند به عنوان سوبسترای ایده ال مطرح می شود[25] معمولأ ذرات کوچک سوبسترا سطح وسیعی را برای حمله میکروبی فراهم می کنند. کوچکی بیش از حد ذرات سوبسترا احتمال تراکم میکروبی را زیاد می کند که خود مانع ازتنفس میکروب ها یا هوادهی شده و نتیجه آن کاهش رشد است.[25] اکثر روش های تخمیر در بستر جامد،فرایند های ناپیوسته هستند اگرچه تلاش هایی در جهت ارتقاء آنها به سیستم های نیمه پیوسته وپیوسته صورت گرفته است.برخی از فرایندها نیازی به بیورآکتور ندارند و از طریق بخش بستربر محیط مناسب صورت میگیرد.فرآیندهایی که برای آنها از ظروف تخمیر استفاذه می شود،نوسانات زیادی دارند[24] |
بررسی نقش لیکوپن بر کاهش کلسترول خون موش نر آزمایشگاهی
 بررسی نقش لیکوپن بر کاهش کلسترول خون موش نر آزمایشگاهیچکیدههدف از پژوهش حاضر، تعیین تأثیر لیکوپن بر کاهش کلسترول خون موش نر آزمایشگاهی بود. به این منظور، 27 سر موش نر آزمایشگاهی در این پژوهش شرکت کردند و بهطور تصادفی به پنج گروه تجربی (23n=، سن: 2 ماه، با میانگین وزنی: 103.7 گرم) و کنترل (4n=، سن: 2 ماه، با میانگین وزنی: 117.5گرم) تقسیم شدند. گروه تجربی به مدت هشت هفته، رژیم غذایی به میزان ده گرم پلت به ازای هر صد گرم وزن موش یک گرم از رژیم غذایی حاوی لیکوپن بود. نمونههای خونی بعد از 12 ساعت، بهصورت ناشتا برای انجام تجزیه و تحلیلهای آزمایشگاهی جمعآوری شد. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از آزمون آماری کولموگروف- اسمیرنف و تی مستقلانجام شد. نتایج نشان داد؛ تغذیه با 100 میلی گرم لیکوپن موجب کاهش معنادار کلسترول پلاسما شد، با میزان جذب لیکوپن 1.65نانومول / میلی گرم (002/0=P)، از طرف دیگر یافته‌ها نشان داد، به دنبال تغذیه با100 و300 میلی گرم لیکوپن موجب کاهش معنادار کلسترول LDL پلاسما شد، با میزان جذب لیکوپن 1.65و1.48نانومول / میلی گرم (0.003و0.00P=)داشت ولی تری گلیسرید، VLDLو HDLاز لحاظ آماری معنادار نبودند. با توجه به نتایج پژوهش حاضر میتوان گفت؛ تغذیه با لیکوپن منجر به کاهش مؤثر چربی بدن شد. در نتیجه، لیکوپن از نظر تأثیر زمانی یک عامل کارآمد برای پیشگیری و بهبود عوامل خطرزای بیماریهای مزمن از جمله بیماریهای قلبی ـ عروقی در موش نر آزمایشگاهی است. کلمات کلیدی: لیکوپن، کلسترول، تری گلیسرید، LDL، VLDL فهرست مطالب عنوان صفحه
فهرست جدول ها
فهرست شکلها
فصل اول طرح پژوهش1-1- مقدم سال‌هاست که الگوی ابتلا به بیماریها و مرگ و میر بر اثر آن در سطح دنیا از بیماری های عفونی همچون سل، به بیماریهای غیر واگیر مانند بیماریهای قلبی- عروقی[1] (CVD)، سرطان، بیماری های مزمن ریوی- تنفسی و دیابت تغییر پیدا کرده است(خالصی، 1386). بیماریهای قلبی عروقی گوناگونی وجود دارند که مهمترین آنها آترواسکلروز[2] می باشد. آترواسکلروز بیماری قلبی پیشروندهای است که از دوران کودکی آغاز می شود و تظاهرات بالینی خود را به طور عمده در بزرگسالان، از میانسالی به بعد آشکار می کند. این بیماری شایعترین بیماری قلبی است که با تجمع غیر طبیعی لیپید، مواد چربی در جدار رگ مشخص می شود و باعث انسداد، تنگی رگ و کاهش جریان خون به عضله میوکارد می گردد. این تجمع مواد را آتروما یا پلاک می گویند. پیشرفت آترواسکلروز را می توان متوقف کرد یا در بعضی موارد نیز آن را برگشت داد. آترواسکلروز عامل اصلی مرگ و میر در دنیای کنونی به شمار می‌رود(روبرگزو رابرت،1384 ؛ عالی زاده و همکاران،1383). بنابراین، درمان بیماری عروق کرونر قلب(CHD)[3] و پیشگیری از پیشرفت بیماری اهمیت فراوانی دارد(تارک و لائوغلین[4] ،2004). عوامل خطرزای متعددی منجر به توسعه بیماریهای قلبی ـ عروقی میشوند که شامل رژیم غذایی نامناسب، چاقی و اضافهوزن، فشار خون بالاو نیمرخ چربی غیر طبیعی است (ریدکر و همکاران[5] ،2001). از دیرباز، نیمرخهای چربی(پروفایل لیپید) به عنوان شاخص بیماریهای قلبی عروقی محسوب شده اند. هر چند، افزایش LDL-C[6] و کاهش HDL-C[7] شاخصهای اصلی و عامل خطر بیماریهای عروقی می باشند. ریدکر و همکاران(2002) دیس لیپیدمی آتروژنیک شامل افزایش غلظت کلسترولLDLخون، کلسترول کل ، تری گلیسیرید و کاهش کلسترول لیپوپروتئین با چگالی زیاد HDL، که غالبا با ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی همراه است درمان اختلالات چربی خطر ابتلا به بیماریهای قلبی عروقی را می تواند کاهش دهد. با مطالعه روی 27939 زن سالم با میانگین سنی 54 سال که به مدت 8 سال با نظارت کامل به طول انجامید، گزارش کردند تقریبا نیمی از کل حوادث قلبی عروقی این مدت در زنانی رخ داده است که مقادیر LDL-C آنها کمتر از 130 میلی گرم در دسی لیتر بوده است. این موضوع نشان می دهد برای کاهش افراد در معرض خطر، به شاخصهای دیگری نیز باید توجه کرد(ریدکر ،2001). در سالهای اخیر ارتباط میان کلسترول و آترواسکلروزیس طی تحقیقات بسیاری اعلام شده است، بر اساس اغلب گزارشات گسترش بیماریهای قلبی عروقی زمینهای تغذیه ایی دارد و رژیم غذایی، نقش محوری در توسعه و پیشرفت آترواسکلروز ایفا می کند(دیوید هابر و همکاران.2013). رژیم غذایی نقش مهمی در غلظت لیپوپروتئین بازی می کند و مداخله اولیه برای بیماران با دیس لیپیدمی دارد . مصرف میوه ها و سبزیجات ، اثرات مفیدی بر روی غلظت لیپوپروتئین داشته است.
شواهد اپیدمیولوژیک نشان میدهد که مصرف زیاد میوهها و سبزیجات خطر ابتلا به بیماریهای مزمن از جمله بیماری قلبی عروقی(CVD) را کاهش میدهد. این فواید بالقوه برای سلامت عروق از رژیم غذایی غنی از گوجه فرنگی اغلب به غلظت بالایی از لیکوپن نسبت داده شده است. لیکوپن منجر به سرکوب جذب کلسترول و به کاهش سطوح کلسترول موجود در حیوانات میگردد. (ماریو لورنز و همکاران.2012)[8] برخی شاخصهای مربوط به چربی خون که پیشگوییکننده بیماریهای قلبی عروقی می باشد، عبارتند از: کلسترول ، HDL،LDL،2 vLDLوتری گلیسرید، با وجود این، پژوهشگران زیادی LDLرا به عنوان شاخص چربی عمده پیشگویی کننده بیماریهای قلبی عروقی معرفی کرده اند (نرمین ان و ناشار و همکاران. 2012)3 از سویی دیگر افزایش LDLدر بیماران یک نقش مهمی در پیشرفت اختلال آندوتلیالی یا آترواسکلروز بازی می کند. سطح سرمی بالای کلسترول لیپوپروتئین با چگالی کم(LDL-C ) به وضوح به خطر بیماری قلبی عروقی(CVD) مرتبط شده است.در نتیجه شیوع سطوح بالا کلسترول نامطلوب ، ممکن است عامل خطربرای بخش بزرگی از بیماریهای قلبی عروقی محسوب شود. با وجود 10 ٪ کاهش درLDL-Cهر دوبا رویکرد رژیم غذایی و یا با عوامل کاهش دهنده چربی با کاهش 25 ٪ از بروزعروق کرونر همراه است. 24٪ کاهشدر مرگ و میر حاصل از عروق کرونر با توجه به کاهش 6٪ و در کلسترول تام جالب توجه است. لیپوپروتئین های کم چگال( LDL) شامل بالاترین سطح کلسترول است.سطح کلسترول لیپوپروتئین با چگالی کم(LDL) حداقل mg / dl60 و نه بالاتر از 100 میلی گرم / دسی لیتر کلسترول LDLبود. این نوع کلسترول خاصیت چسبندگی دارد و به راحتی به جدار داخلی دیواره ی رگ ها می چسبد و باعث باریک شدن و در نهایت انسداد مجرای داخلی رگ ها می گردد. از این رو به کلسترول بد معروف است. لیپو پروتئینیکه بر خلاف عملLDLبا از بین بردن کلسترول ازسرخرگ ها و انتقال آن به کبد برای دفع ایمنآن عمل می کند.اگر کلسترولLDLعلت آترواسکلروز باشد ، منطق حکم می کند کهباید یک ارتباط قوی بین سطح خونکلسترولLDLو تصلب شرایین وجود داشته باشد . با این حال ، یک بررسیشواهد موجود در غیر این صورت را نشان می دهد.به رغم تصور رایج، پلاک های آترواسکلروتیکتوده ساده بزرگی از چربی و کلسترول که به دیوار سرخرگ چسبیده هستند. رشد پلاک های آترواسکلروتیکدر درجه اول در داخل دیواره عروق ، بین لایه های درونی و بیرونی را می گیرد . پلاک مجموعه ای ازتعداد زیادی ازقطعات ، از جمله سلول های ماهیچه ای صاف ، کلسیم، بافت همبند ، سلول های سفید خون ، کلسترول و اسیدهای چرب می باشد.هنگامی که کلسترولLDLبیش از حد در گردش خون وجود داشته باشد، به آرامی می تواند در دیواره داخلی سرخرگ ها که قلب و مغز را تغذیهمیکند رسوب کند.همراه با مواد دیگر می تواند پلاک را تشکیل دهند، رسوبی ضخیم و سخت که می تواند شریان را مسدود کند . این وضعیت به عنوان آترواسکلروز شناخته شده است. اگر لخته تشکیل شود در یک سرخرگ و آن را مسدود کند، می تواند منجر به یک حمله قلبی یا سکته مغزی شود. تغذیه میزان کلسترول را در بدن افزایش می دهد.با این حال، تجمع کلسترول در بافت ها با افزایش مصرف کلسترول رژیم غذایی همراه است که از طریق کاهش جذب کسری و یا مانع سنتز کلسترول و دفع کلسترول افزایش یافته است. (ساشا فرانکت و همکاران.2012)[9] سطح بالا کلسترول LDLنشاندهنده عامل خطر توسعه و پیشرفت بیماریهای قلبی عروقی است. برای کاهش mg/dl25 کلسترول LDLاز خطر عمده مرگ و میر عروقی 11% و حوادث کرونری 16% کاهش مییابد. نسبت HDL/LDLبرای حوادث جانبی قلبی عروقی پیش بینی شده است . اگر چه لیکوپن سطوح کلسترول HDL را افزایش نمیدهد. (ماریو لورنز و همکاران.2012)[10] از طرف دیگر، لیکوپن بوسیله بهبود متابولیسم چربی و فشار خون بالا، عوامل خطرزای قلبی ـ عروقی را متوقف میکند. اگر چه، یک مقدار و شدت بهینهای از لیکوپن برای توقف هر یک از عوامل خطرزا وجود دارد، اما قابلیت شدت بالا یا یک مقدارکم از لیکوپن برای توقف یا پیشگیری از عوامل خطرزای قلبی عروقی تا حد زیادی شناخته نشده است. بنابراین شدت و مقدار بهینه لیکوپن برای پیشگیری از عوامل خطرزای قلبی عروقی و ارتباط بین اثرات ناشی از لیکوپن بر عوامل ذکر شده، نیاز به توضیح بیشتری درآینده دارد. 1-2- بیان مسئلهسالها قبل از آنکه ارتباط بین کلسترول و برخی از بیماریها کشف شود، دانشمندان اهمیت کلسترول را درک نکرده بودند. مطالعات انسانی و حیوانی فراوان نشان می دهند کلسترول در سلامتی و بیماریها اهمیت دارد. در حال حاضر، روشن شده است که در یک فرد سالم، عملکرد کلسترول برای فرآیندهایی نظیر، التهاب و رشد و یکپارچگی عروق[11] ضروری است. اختلال در عملکرد کلسترول ، علت اصلی پیشرفتهای پاتولوژیک در بسیاری از بیماریها مثل سرطان، نقصهای ایمنی و بیماریهای قلبی عروقی است. دستگاه گوارش تنظیم سوخت و ساز بدن از چربی های بیرونی ، در حالی که کبد ارگان های اصلی برای سنتز و ترشح چربی درون زا و اسیدهای صفراوی است. کلسترول قابلیت انحلال در آب ندارد .حمل و نقل کلسترول در سیستم گردش خون توسط لیپوپروتئین تسهیل می شود. لیپوپروتئین ذرات کروی و شامل هسته آبگریز کلسترول و تری گلیسیرید استری و اطراف پوسته هیدروفیل از آپولیپوپروتئین ، فسفولیپیدها، وغیر استریفیه شده کلسترول می باشد . با توجه به تراکم دراولتراسانتریفیوژ، لیپوپروتئین های پلاسما می تواند.95-1.006 : به[12]شیلومیکرون < 0.95گرم / میلی لیتر ، لیپوپروتئین با چگالی بسیار پایین ( VLDL)گرم / میلی لیترLDL 1.006-1.019 گرم / میلی لیتر( 1.019-1.063) و لیپوپروتئین با دانسیته بالا(( HDL : 1.063-1.210گرم / میلی لیتر،شیلومیکرونولیپوپروتئین به نام تری گلیسرید[13] ( TGRL) در انسان، حدود 70 درصد از کلسترول پلاسما است. کلسترول بدن انسان را توسط عواملزیر تنظیم میکند: 1.دریافت غذایی کلسترول2 . جذب روده ای کلسترول و تشکیل لیپوپروتئین پس از صرف غذا3 . انتقال معکوس کلسترول از بافت های محیطی4 . جذب کبدی لیپوپروتئین های گیرنده درون زا 5.سنتز کلسترول عمدتا کبدی6 . ترشح کبدی لیپوپروتئین7 . سنتز اسید صفراوی8 . جذب کلسترول توسط بافت های محیطی9 . دفع صفراوی و رفع مدفوع کلسترول و اسیدهای صفراوی .در شرایط عادی، سنتز درونی از کلسترول دو سوم کمک از ورودی کلسترول تام به کل بدن. تغذیه میزان کلسترول را در بدن افزایش می دهد.با این حال،تجمع کلسترول در بافت ها را افزایش مصرف کلسترول رژیم غذایی است که از طریق کاهش جذب کسری و یا مانع سنتز کلسترول و دفع کلسترول افزایش یافته است. تنها تعداد محدودی از مطالعات که بررسی ارتباط بین متابولیسم کلسترول و تصلب شرایین وجود دارد . در تعداد محدودی از بیماران عروق کرونر (9 نفر ) با هایپرکلسترومی اولیه ، اما نه درکسانی که باکلسترول طبیعی، سنتز کلسترول کمتر از گروه شاهد به نظر می رسد.(ساشا فرانکت و همکاران.2012)[14] برخی از ذرات لیپوپروتئین با چگالی کم )(LDLمی تواند به شریان عروق کرونر صدمه وارد کند و برخی از ذرات لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL) می تواند کمک به محدود کردن آسیب نمایند. از این رو، سطح پلاسمایی کلسترولLDL و کلسترولHDL مقدار کلسترول کل که حاوی ذراتLDLوHDLهستند،به ترتیب عوامل خطر منفی و مثبت برای بیماری عروق کرونر قلب هستند. پیش سازهای ذراتHDLدر ابتدا کوچک ( حاوی هیچکلسترول )هستند و پس از آن بارها به دست آوردن کلسترول خون و برخی ازکلسترول را از دست می دهند .در مجموع، ذراتHDL (پیش سازهای آنها ) می تواندمعکوس،کلسترول اضافی از بافتهای محیطی، ماننددیواره شریان باشند.(سو- کیونگ چوی و همکاران.2013)[15] کلسترول خون بالا روی هر کسی تاثیر می گذارد. این یک شرایط خطرناک که خطر بیماری قلبی را افزایش می دهد و قاتل شماره یک زنان و مردان آمریکایی است . سطح بالاتر کلسترول خون ، بیشتر در معرض خطر قرار می دهد. کلسترول در جریان خون در گردش است ، اما به خودی خود حرکت نمی کند. بنابراین کلسترول توسط بسته هایی به نام لیپوپروتئین منتقل می شود ،که چربی داخل و پروتئین خارج آن قرار دارد.دو نوع اصلی لیپوپروتئین در خون کلسترول را حملمی کند:لیپوپروتئین کم چگالی LDL، که همچنین به کلسترول "بد " نام دارد، به دلیل آن که کلسترول را به بافتها، از جملهشریان هاحملمی کند.بیشتر کلسترول در خون به شکلLDLاست. با بالاتر رفتن سطح کلسترولLDLدر خون، خطر ابتلا به بیماری های قلبی افزایش می یابد.لیپوپروتئین با چگالی بالا یا HDL، که کلسترول "خوب" نیز نامیده می شودبه دلیل آن کلسترول از بافت ها بهکبد منتقل می کند، که آن را از بدن حذفنماید. سطح پایین HDL کلسترول خطر ابتلا به بیماری های قلبی را افزایش می دهد . اگر کلسترول بیش از حد در خون وجود دارد ، مقدار زیادی از آن می توانددر دیواره شریان ها به دام افتد. با گذشت زمان، این چیزساخته شده پلاک نامیده می شود . پلاک می تواند عروق را تنگ و انعطاف پذیری آنها را کمتر و در نهایت باعث یک بیماری به نام آترواسکلروز یا " سخت شدنشریان ها" می شود. از آنجا که کلسترول بالا خون بر عروق کرونر تاثیر می گذارد ، در نتیجهیک عامل خطر عمده برای بیماری های قلبی است.(پروفسور.پورن پن سریساواسدی.2012)[16] لیپیدها شامل یک گروه گسترده ای از مولکول های طبیعی که شامل چربی ،استرول از جمله کلسترول ، محلول در چربی ویتامین ( مانند ویتامین هایA، D، EوK،مونوگلیسریدهای، دی گلیسریدهای، تری گلیسیرید، فسفولیپیدها است. لیپیدها به عنوان منابع ذخیره سازی انرژی و بلوک های ساختمانی برای غشای سلولی شناخته شده است. تمام چربی ها به عنوان مولکول های کوچک آبگریز یاآمفی لیپیک تعریف شده اند. طبیعتآمفی لیپیک برخی از چربی آنها را به شکل ساختارهای مانند وزیکول ،لیپوزومها و یا غشاء در محیط آبی اجازه می دهد. این مجموعه تشکیل شده توسط اتصال از چربی به عنوان مثال پروتئین لیپوپروتئین، باعث می شود چربی های محلول در آب، که حمل و نقل آن در خون قادر می سازد.ذرات لیپوپروتئین ازپوسته بیرونی فسفولیپیدها، که ذرات محلول در آب، یک هسته از چربی به نام چربی خون شامل کلسترول و سطح آپوپروتئین تشکیل شده است. لیپوپروتئین باید در توصیف از نظر اجزای پروتئین های مختلف ( آپولیپوپروتئین ) دلیل این امر، تعیین ساختار کلی و سوخت و ساز بدن از لیپوپروتئین و تعامل با گیرنده مولکول ها در کبد و بافت های محیطی است. این مولکول آپولیپوپروتئین بافت را به تشخیص و برداشتن ذرات لیپوپروتئین قادر می سازد. مطالعات متعدد نشان می دهد ارتباط قوی بین خوردن فیتوکمیکالها و کاهش بیماریهای قلبی وعروقی وجود دارد.فلاونویدها رابطه عکس با مرگ و میر ناشی از بیماریهای عروق کرونر، کلسترول تام پلاسما و لیپوپروتئین اکسید شده عامل تجمع چربی در دیواره عروق وLDLبا دانسیته پایین دارند. لیپوپروتئین با دانسیته پایین ابتلا به بیماریهای قلبی است. فیتوکمیکال ها همچنین سبب کاهش تجمع پلاکت شده و سنتز کلسترول و جذب آن را تعدیل کرده سبب کاهش فشار خون می شوند.(دانیال کواواس- راموس.2013)[17] سطح بالا کلسترول LDLنشاندهنده توسعه عامل خطر و پیشرفت بیماریهای قلبی عروقی است. برای کاهش mg/dl25 کلسترول LDLاز خطر عمده مرگ و میر عروقی 11% و حوادث کرونری 16% کاهش مییابد. نسبت HDL/LDLبرای حوادث جانبی قلبی عروقی پیش بینی شده است. اگرچه لیکوپن سطوح کلسترول HDLرا افزایش نمیدهد.(ماریو لورنز و همکاران.2012)[18] در سالهای اخیر بسیاری از مطالعات به وضوح نشان داده اند ، افزایش کلسترول می تواند در حالتهای پاتولوژیکی نظیر متاستاز تومورها، پاسخهای التهابی و ... ایفای نقش نماید(عالی زاده و همکاران1383؛وجگانی.1383 ). شواهد رو به افزایشی نشان می دهند، کلسترول نقش مهمی در پاتوژنز آترواسکلروز دارند. چسپیدن کلسترول موجود در خون به سطح شریانها ، یکی از نخستین وقایع شناسایی در آترواسکلروز محسوب می گردد(عالی زاده و همکاران1383 ؛جگانی 1383؛ عندلیب و همکاران 1385). از سویی دیگر، میزان شاخص چربیهای خونی مثل کلسترول، تری گلیسرید،LDL،HDL،vLDL بعنوان پیشگوییکننده های قوی حوادث قلبی عروقی مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته و اشاره شده که اندازهگیری کلسترول، تری گلیسرید،LDL،HDL،vLDL ابزار سودمندی در تشخیص موثر عوامل مختلف محیطی در اختلالات عروقی بوده به منظور مارکرهای مولکولی آترواسکلروز و پیشگوییکننده بیماریهای قلبی کرونری(CHD) مورد مطالعه قرار دادند. اخیرا مشخص شده است که ترشحات بافت چربی از فاکتورهایی است که نقش مهمی را در جایگاهها و تنظیم سیستماتیک متابولیک متعدد در فرآیند التهابی اعمال می کند(هالوزیک وهمکاران[19]،2004). در واقع چاقی تقریبا با تمامی عوامل خطرزای CVDارتباط دارد (مسموری و اندرسن[20]،2009)، بنابراین پیشگیری از افزایش وزن بیش ازحد، حیاتی است و دو علت اصلی اضافه وزن و چاقی درجوانان، رژیم غذایی نامناسب و عدم فعالیت بدنی میباشد. اگرچه مصرف منظم لیکوپن یک عامل پیشگیریکننده مهم در برابر خطر ابتلا بهCVD در آینده است (استرانگ وهمکاران[21] ،2005)، اما مطالعات اخیر نشان میدهند سطح فعلی لیکوپن، برای پیشگیری از بیماریهای قلبی عروقی کافی نیست (مسلوری[22]،2009). سطوح پایین آمادگی قلبی عروقی و لیکوپن، عوامل مشترک در هر یک ازبیماریهای متابولیک و قلبی عروقی هستند(استیل وهمکاران[23] ،2008). تعداد زیادی از جوانان حداقل یک یا چند عامل خطرزای قلبی عروقی را دارند که به احتمال زیاد آن را تا دوران بزرگسالی حفظ میکنند(توماس وویلیامز[24]،2008)و شیوع عوامل خطرزای بیماری قلبی عروقی در جوانان با توجه به معیارها و جمعیت استفاده شده بین صفرو 60٪متفاوت است(ایکلوندوهمکاران[25] ،2004). با وجود فواید سلامتی زیاد لیکوپن، بسیاری از برزگسالان به علت نداشتن زمان کافی به عنوان یک مانع مهم در لیکوپن شرکت نمیکنند. بنابراین، مطالعه یک برنامه لیکوپن جایگزین با سازگاریهای متابولیکی مشابه و بدون تعهد زمانی قابل ملاحظه مورد نیاز است. یکی از پروتکلهای رژیم غذایی لیکوپن که اخیرا ًمورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. مطالعات قبلی نشان دادند که 6 هفتهلیکوپن در مقایسه با تحقیق ما منجر به سازگاریهای متابولیکی مشابهی شده است (آگارول و همکاران[26]،1988). همچنین، تحقیقات پیشین نشان دادهاند، اجرایلیکوپن ظرفیت اکسایش چربی و فعالیت آنزیمهای میتوکندریایی را افزایش میدهد (حسن وهمکاران[27]،2004). اخیراً نیز گزارش شده است که کاهش کلسترول کل برای 3 هفته با رژیم غذایی حاوی گوجه فرنگی بالا (27 میلی گرم لیکوپن در روز) به طور متوسط 5.9% و12.9% بود، در حالی که مصرف روزانه 250 میلی لیتر آب گوجه فرنگی به مدت 2 هفته در 24 فرد بزرگسال(41.8 میلی گرم لیکوپن در روز) کاهش کلسترول پلاسما به طور متوسط 3% بود. در مطالعه غلظت چربی در گردش خون در هر دو گروه گوجه فرنگی بالا و مکمل لیکوپن در مقایسه با گروه شاهد بدون تغییر باقی مانده است. (فرانک وهمکاران[28]،2013) در یک مطالعه کوچک ، شش نفر از افراد سالم انسان 60 میلی گرم / روز لیکوپن برای مدت 3 ماه مصرف می شود(سانجیو آگاروال و همکاران.2000)[29] . درصد کاهش کلسترول LDLپلاسما خود را در پایان دوره درمان نشان می دهد کهکاهش کلسترول توسط لیکوپن مشاهده شده است. با این حال، مطالعات دیگر، با استفاده از سطوح مختلف مصرفلیکوپن برای دوره های کوتاه تر به کاهش سطوح کلسترول تام و LDLسرم پس از خوردن لیکوپن گزارش نمی دهند.مطالعات اپیدمیولوژیک و شواهد آزمایشگاهی در حمایت از نقش لیکوپن در پیشگیری از CHDوجود دارد، تنها چند کارآزمایی بالینی تا کنون انجام شده است. در نتیجه، این پرسش که آیا لیکوپن می توانند اثرات مفید در کاهش خطر ابتلا به خصوص بیماری های قلبی عروقی داشته است، به شدت مورد بررسی قرار گرفت، اما نتایج بی نتیجه باقی مانده است . (ارال اس.فورد همکاران . 2003)[30]. بنابراین با توجه به قابلیت بالای این شیوه رژیم غذایی در کاهش چربی بدن، کارآمد بودن آن از لحاظ زمانی و نبود پژوهش مشابه در زمینه تأثیر غلظت های (صفر،100و300 میلی گرم) لیکوپن بر تغییرات میزان کلسترول، انجام پژوهش حاضر ضروری به نظر میرسد. با این وجود، پژوهش حاضر در صدد پاسخگویی به سوالات زیر است: آیا مصرف هشت هفته لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول تاثیر دارد؟ آیا مصرف هشت هفته لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول LDL تاثیر دارد؟ آیا مصرف هشت هفته لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول HDLتاثیر دارد؟ آیا مصرف هشت هفته لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول VLDLتاثیر دارد؟ آیا مصرف هشت هفته لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی تری گلیسرید تاثیر دارد؟ 1-3- اهمیت و ضرورت پژوهشبیماریهای قلبی عروقی گوناگونی وجود دارند که مهمترین آنها آترواسکلروز می باشد. این بیماری ها از علت اصلی مرگ و میر در مردان و زنان در دنیای صنعتی به شمار می رود(جسیکاوهمکاران[31] 2005؛ ریدکر وهمکاران[32]2002). هرچند وجود بیماری شناخته شده کرونر قلب، خطر مرگ و میر ناگهانی را تا حدود زیادی افزایش می دهد، ولی قبل از مرگ، بیشتر از نصف قربانیان مرگ و میرهای ناگهانی قلبی، از نظر بالینی بیماری کرونر قلب آنها تشخیص داده نمیشود(اک[33]،2000). دگرگونیهای سریع اقتصادی اجتماعی دهههای اخیر در بسیاری از کشورهای شرق مدیترانه و خاورمیانه از جمله ایران موجب شده است بیماریهای قلبی عروقی یک مشکل عمده بهداشتی و اجتماعی به شمار آید که ابعاد آن به سرعت در حال گسترش است(عزیزی وهمکاران ،1379). لذا شناخت عوامل موثر در پیدایش بیماریهای قلبی عروقی می تواند نقش مهمی در پیشگیری از پیشرفت بیماری داشته باشد . گزارش ها نشان می دهد عوامل خطر سنتی بیماریهای قلبی عروقی(نیمرخ لیپیدها) در شناسایی بسیاری از افراد در معرض خطر کارائی نداشته است(دبیدی وهمکاران 1384؛بلک و ریدکر 2001). لذا سنجش شاخص کلسترول می تواند در تشخیص افراد مستعد بیماری قلبی عروقی کمک کند. در این باره بیشتر پژوهشگران کلسترول را به عنوان شاخصی در پیشگویی و پیش بینی خطر حوادث قلبی عروقی معرفی کرده اند(عالی زاده وهمکاران1383، بالک وریدکر[34]،2001). از سویی دیگر مطالعات زیادی نشان دادند که افزایش کلسترول گردشی در بیماران چاق نقش مهمی را در پیشرفت آترواسکلروز یا اختلال آندوتلیالی بازی می کند(بلامکنبرگ وهمکاران 2003؛بوسانسکاوهمکاران ،2009). همچنین یک التهاب تحت بالینی دائم در بیماری چاقی درگیر است و با ضایعاتی مانند مقاومت انسولین، اختلال افزایش میزان لیپید در خون و آترواسکلروز رابطه دارد(دیوریج وهمکاران 2004؛ پریس وهمکاران ،1999). بنابراین مطالعات نشان داده است، غلظت کلسترول پلاسما در افراد چاق و دارای اضافه وزن در مقایسه با افرادی که وزن نرمال دارند بیشتر می باشد(بوسانسکاوهمکاران 2009،لییون وهمکاران [35]2003،هوپ ومردیت[36] 2003،کواسنیکاوهمکاران[37] 2003). لذا با توجه به ارتباط قوی که بین شاخصهای کلسترول و شیوع انواع بیماریها بخصوص بیماریهای قلبی عروقی دیده شده، هر گونه اقدامی که باعث کاهش شاخصهای کلسترول شود، می تواند احتمال بروز حوادث قلبی عروقی را کاهش دهد(توسولیس وهمکاران[38] 2003ویاشیرو2000[39]). با توجه به این خطرات ، شناسایی عوامل و متغیرهای بیوشیمیایی مهم در توسعه روند بیماریهای قلبی ـ عروقی از اهمیت قابل توجهی برخوردار است . نکته مهمتر شناخت و درک تأثیر لیکوپن بر این عوامل بیوشیمیایی که در صورت مشخص شدن تغییرات مثبت و تعدیلکننده در این متغیرها به عنوان یک راهبرد تندرستی موثر در کنترل روند این بیماریها درنظرگرفته خواهد شد. نظر به اهمیت مباحثی که مطرح شد، ضرورت دارد که پژوهشهای علمی در این زمینه صورت گیرد. از این رو با در نظر گرفتن این امر که زمینهی آترواسکلروز در سنین کودکی و نوجوانی ایجاد میشود، پژوهش حاضر تأثیر هشت هفته اجرای رژیم غذایی بر پیشگیری از برخی شاخصهای مهم پیشگوییکننده بیماریهای قلبی عروقی مانند کلسترول در موش نر آزمایشگاهی را مورد بررسی قرار می دهد. 1-4- اهداف پژوهش1-4-1-هدف کلیتعیین تاثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول در موش نر آزمایشگاهی. 1-4-2-اهدافاختصاصیتعیین تأثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول در موش نر آزمایشگاهی تعیین تأثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترولLDL در موش نر آزمایشگاهی تعیین تأثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول HDLدر موش نر آزمایشگاهی تعیین تأثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترولvLDL در موش نر آزمایشگاهی تعیین تأثیر لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی تری گلیسرید در موش نر آزمایشگاهی 1-5 - فرضیه های پژوهشلیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول در موش نر آزمایشگاهیتأثیر دارد. لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول LDL در موش نر آزمایشگاهی تأثیر دارد. لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترولHDL در موش نر آزمایشگاهی تأثیر دارد. لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی کلسترول vLDLدر موش نر آزمایشگاهی تأثیر دارد. لیکوپن بر مقادیر پلاسمایی تری گلیسرید در موش نر آزمایشگاهی تأثیر دارد. 1-5-1- پیشفرضپژوهشابزار و وسایل اندازه گیری متغیرها دارای شرایط استاندارد بوده است. محقق تمام توانایی و تلاش خود را در انجام تغذیه به کار گرفته بود. گروهها از سلامت کامل جسمی برخوردار بودند. 1-6 - قلمرو و محدودیتهای پژوهش1-6-1- محدودیتهایپژوهشسطح لیکوپن گروهها در گذشته و رعایت شیوه غذائی بر اساس خودگزارشی محقق بوده است که احتمال خطا نیز وجود دارد. ناهمسان بودن سطح لیکوپن گروهها ویژگیهای ژنتیکی و مادرزادی گروهها که بر تغییر و تعدیل کلسترول اثرگذار هستند. 1-6-2-قلمروپژوهشجنس گروهها: پژوهش مورد نظر در جامعه موش های نر آزمایشگاهی صورت گرفت. وزن گروهها: موش های مورد مطالعه در دامنه وزنی 120-150 گرم قرار داشتند. سابقه مصرف لیکوپن گروهها: گروهها حداقل در یک ماه قبل از پژوهش در هیچ برنامه غذایی حاوی لیکوپن دریافت نکرده بودند. متغیرهای کنترل: تغذیه تحت کنترل محقق بوده است. گروههای سالم و بدون مصرف لیکوپن جهت شرکت در پژوهش انتخاب شدند. تغذیه با لیکوپن به مدت هشت هفته و هر روزی یک بار در نظر گرفته شد. 1-7- تعاریف واژه ها: کلسترولکلسترول ماده ای از جنس چربی که در تمام سلول های بدن وجود دارد، در کبد یا روده تولید می شود. در ساخت دیواره ی سلولی و برخی هورمون ها نقش مهمی ایفا می کند.به عنوان یک جزء ساختاری ضروری غشای سلول های پستانداران، برای ایجاد نفوذ پذیری و سیالیت غشاء لازم است. مولکول های چربی پس از جذب از روده در سیستم گردش خون توسط کلسترول حمل می شوند. قسمت اعظم کلسترول در داخل بدن و توسط کبد ساخته می شود و بقیه آن با مصرف غذاهای پر چرب وارد بدن می شود. کلسترول هم نوعی چربی است که در ساختمان غشای سلول های بدن و لیپوپروتئین های خون وجود دارد و برای تشکیل برخی از مواد ضروری بدن مانند هورمون جنسی و نمک های صفراوی ضروری است. علاوه بر این، کلسترول جزء مهمی برای ساخت اسیدهای صفراوی، هورمون های استروئیدی، ویتامینD، کلسترول استرول اصلی سنتز شده توسط جانوران است، اما به مقدار کم در یوکاریوت های دیگر مانند گیاهان و قارچ ها می تواند سنتز شود. اما در میان پروکاریوت ها از جمله باکتری ها وجود ندارد. با توجه به حلالیت محدود آن در آب، کلسترول در خون توسط لیپوپروتئینها منتقل می شود.لایه بیرونی لیپوپروتئین از کلسترولآمفی لیپیکو تشکیل مولکول فسفولیپید با پروتئین که دور یک هسته آبگریز تری گلیسرید و استرهای کلسترول است. لیپوپروتئین ها به طور خاص سلول های آپولیپوپروتئین مجزا در سطح آنها را هدف قرار داده است که به گیرنده های خاص متصل شوند. لیپوپروتئین های کم چگال( LDL) شامل بالاترین سطح کلسترول است. مواد غذایی گیاهی مانند میوه ها، سبزیجات و غلات و حبوبات کلسترول ندارند. کلسترول و سایر چربی ها نمی تواند در خون حل شوند. آنها باید از سلول ها توسط حامل های خاصی به نام لیپوپروتئین حمل می شوند. کلسترول خون شامل کلسترول HDL(کلسترول خوب) و کلسترول LDL(کلسترول بد) است.(شکل1-1) شکل1‑1مولکولکلسترول 1-7-1-کلسترول LDL لیپوپروتئین با چگالی کمLDL، به عنوان کلسترول "بد" شناخته شده است.افزایش کلسترول LDLخون موجب فراهم شدن زمینه برای ابتلا به فشارخون بالا و افزایش ابتلا به بیماری قلبی- عروقی می شود. 1-7-2-کلسترولHDL لیپوپروتئین با چگالی بالاHDL، به عنوان کلسترول "خوب" شناخته شده است.بدن کلسترولHDLبرای محافظت از ما می سازد .کلسترول را حمل و از شریان دور می کند. مطالعات نشان می دهد که سطح بالای کلسترولHDL، خطر ابتلا به حمله قلبی را کاهش می دهدو از ابتلا به بیماری قلبی- عروقی پیشگیری می کند .(شکل2-1 1-7-3-لیپوپروتئین بسیار کم‌چگالVLDL لیپوپروتئین بسیار کم‌چگال به اختصار وی.ال.دی.ال (Very-low-density lipoprotein)، نوعی از لیپوپروتیئن‌ها میباشد که در کبد ساخته میشود. وی. ال. دی. ال یکی از ۵ دسته اصلی لیپوپروتئینها میباشد که در نقل و انتقال چربی‌ها و کلسترول در جریان خون نقش دارد. لیپوپروتئین بسیار کم‌چگال در کبد از تری‌گلیسیرید، کلسترول و آپولیپوپروتئین ساخته میشود. این لیپوپروتئین در جریان خون به لیپوپروتئین کم‌چگال تبدیل میشود. ذرات وی. ال. دی. ال به اندازه ۳۰ تا ۸۰ نانومتر میباشند. وظایف وی. ال. دی. ال در نقل و انتقال تری‌گلیسیرید، فسفولیپید، کلسترول و استرهای کلسترول نقش دارد. این نقش به عنوان سازوکار انتقال چربی‌ها در داخل بدن است. تغییرات صورت گرفته در جریان خون و ساختار یک لیپوپروتئین بسیار کم‌چگال (وی. ال. دی. ال) تازه ترشح شده از کبد، دارای آپولیپوپروتئین ب۱۰۰، آپولیپوپروتئین سی۱، آپولیپوپروتئین ئی، کلسترول، استرهای کلسترول و تری‌گلیسیرید میباشد. در جریان خون این لیپوپروتئین، آپولیپوپروتئین سی۲ و آپولیپوپروتئین را از لیپوپروتئین پرچگال میگیرد. در این حالت، وی. ال. دی. ال بالغ به وجود می‌آید. در گردش خون، وی. ال. دی. ال ممکن است با لیپوپروتئین لیپاز در بستر مویرگی برخورد کرده و این آنزیم، تری‌گلیسیرید را برای تولید انرژی و ذخیره‌سازی آن، جدا میکند.در این حالت وی. ال. دی. ال، آپولیپوپروتئین سی۲ را به اچ. دی. ال برمی‌گرداند. همچنین اچ. دی. ال، استرهای کلسترول را به لیپوپروتئین بسیار کم‌چگال در ازای فسفولیپید و تری‌گلیسیرید میدهد. سپس تری‌گلیسیرید بیشتری از لیپوپروتئین بسیار کم‌چگال جدا شده و تبدیل به لیپوپروتئینی با چگالی بیشتر از خود میشود. ۵۰ درصد از این لیپوپروتئین، توسط گیرنده‌های کبد شناخته شده و وارد سلول میشود. ۵۰ درصد باقی‌مانده آپولیپوپروتئین ئی خود را از دست میدهند و تبدیل به لیپوپروتئین کم‌چگال شده و در نهایت جذب میشود.(شکل3-1) شکل3-1مولکولVLDL 1-7-4-تری‌گلیسرید تری‌گلیسرید (triglyceride) نوعی لیپید است که در بدن انسان نقش مهمی ایفا میکند.در بافتهای چربی بدن، تری گلیسرید نقش عایق بندی و ذخیره انرژی را دارد. تری گلیسرید از یک گلیسرول و سه اسید چرب تشکیل یافته‌است. تری گلیسرید یا تری آسیل گلیسرول از ترکیب یک الکل سه عامله به نام گلیسرول و سه اسید چرب ایجاد می شود. نام اختصاری آن T.Gاست .T.Gشکل مهمی از ذخیره انرژی است و نسبت به قندها دارای میزان انرژی نهفته بیشتری است. همچنین این مولکول ازنظر شیمیایی مولکولی بی اثر(inert) است و خصلت آب گریزی آن نیز از وجوه متمایزکننده آن نسبت به کربوهیدرات هاست. تری گلیسرید جزء اصلی لیپوپروتئین های با دانسیته خیلی کم (VLDL) و شیلومیکرون(CHY) است. جذب تری گلیسریدهای غذا در روده و پس از اثر آنزیم لیپاز و تجزیه آنها به مونوگلیسرید صورت می گیرد. سپس در سلول های روده مجدداً تری گلیسرید تشکیل و ازطریق کیلومیکرونها و سیستم لنفاوی وارد گردش خون وریدی می شود. محل اصلی متابولیسم تری گلیسرید در بدن سلول های کبد و سلول های چربی است.(شکل4-1) شکل4-1مولکول تری گلیسرید 1-7-5-موش نر آزمایشگاهی منظور از موش نر آزمایشگاهی، موش هایی با دامنه وزنی 120 تا 125 گرم که از انستیتو پاستور تهران خریداری شده بودند که هیچ نوع برنامه منظم و سازمان یافته نداشتند و فقط مشغول فعالیتهای روزانه خود بودند. رژیم غذایی حاوی لیکوپن با دوزهای مختلف:این رژیم غذایی حاوی دوزهای (100،300وصفر میلی گرم) لیکوپن و در حضور کلسترول 2% و عدم حضور کلسترول است. [1]-Cardiovascular Disease [2]-Atherosclerosis [3]-Coronary Heart Diseas 4-Turke and laughlin 5-Ridker et al [6]-Low density lipoprotein [7]-High density lipoprotein 3- David heber et al [8]- Mario lorenz et al 2-Very low density lipoprotein 3- Nermin Nn et al
1-Saša frank at al 2-Mario lorenz et al [11]-Vascular growth and integrity 2-Chylomicrons 3- Triglycerides [14]- Saša franket et al [15]- Soo kyong choi et al [16] -Pornpen srisawasdi Phd et al [17]-Daniel cuevas ramos et al [18]-Mario lorenz et al [19]-Haluzik et al [20]-McMurrayand andersen [21]-Strong et al [22]-McLure et al [23]-Steele et al [24]-Thomas and williams [25]-Ekelund et al [26]- Sanjiv agarwal et al [27]-Hasan et al [28]- Frank et al [29]- Sanjiv agarwal et al 5-Oral s ford et al [31]-Jessica et al [32]-ridker et al [33]-AK Abbas et al [34]-Black and ridker [35]-Lyon et al [36]-Hope SA and Meredith IT [37]-Kvasnicka et al [38]-Tousoulis et al [39]-Yashiro |
A Review on Medicinal Plants with Anti-Ulcer Activity
 A Review on Medicinal Plants with Anti-Ulcer Activityترجمه دقیقا ( منظور رنگ بعضی لغات و ...)با مقاله انگلیسی تنظیم شده و به طبع آن از کیفیت عالی برخوردار است |