دانلود فایل

بزرگترین مرجع دانلود فایل

دانلود فایل

بزرگترین مرجع دانلود فایل

Dynamic simulation of grinding circuits




یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:19
0 نظر

حل مسائل مدارهای الکتریکی 1 و 2 ویلیام هیت به صورت PDF و به زبان انگلیسی در 990 صفحه

حل مسائل مدارهای الکتریکی 1 و 2 ویلیام هیت به صورت PDF و به زبان انگلیسی در 990 صفحه

حل مسائل مدارهای الکتریکی 1 و 2 ویلیام هیت به صورت PDF و به زبان انگلیسی در 990 صفحه

مدارهای الکتریکی، از بهم پیوستن افزاره‌های الکتریکی یا نافعّال (مقاومت، خازن، القاگر، لامپ، و …) یا افزاره‌های الکترونیکی یا فعّال (دیود، ترانزیستور، IC، و …) یا ترکیبی از آن دو پدید می‌آید؛ چنانکه دست کم یک مسیر بسته را ایجاد کنند و جریان الکتریکی بتواند در این مسیر بسته جاری شود.

اگر عنصرها مشکّل مدار الکتریکی باشند، «مدار الکتریکی» نامیده می‌شود، و اگر عنصرها الکتریکی و الکترونیکی باشند، مدار الکترونیکی است.

هر مدار الکتریکی از مؤلّفه‌های اصلی زیر تشکیل شده است:

  1. یک منبع تغذیه‌ی الکتریکی مانند باتری یا مولّد؛
  2. سیم‌های رابط: سیم‌ها یا نوارهای ارتباط‌دهندهٔ مدار، از یک مادّهٔ خوب رسانای الکتریسیته مانند مس تشکیل می‌شوند.
  3. «مصرفگر» یا بار: وقتی می‌گوییم یک مدار الکتریکیْ تشکیل شده است که اتصال‌دهنده‌ها و سایر افزاره‌ها، یک حلقهٔ بسته را پدید آورده باشند. تنها در این صورتست که جریان برق برقرار می‌شود.
  4. افزاره‌های مداری: همچون خازن، مقاومت، القاگر، تَرادیسَنده و دیود.

 

فهرست مطالب:

  • INTRODUCTION (مقدمه)
  • BASIC COMPONENTS AND ELECTRIC CIRCUITS (المان های پایه ای و مدارهای الکتریکی)
  • VOLTAGE AND CURRENT LAWS (قانون های ولتاژ و جریان)
  • BASIC NODAL AND MESH ANALYSIS (تحلیل گره و مش)
  • HANDY CIRCUIT ANALYSIS TECHNIQUES (روش های تحلیل مدار دستی)
  • THE OPERATIONAL AMPLIFIER (تقویت کننده عملیاتی)
  • CAPACITORS AND INDUCTORS (خازن ها و القاگرها)
  • BASIC RL AND RC CIRCUITS (مدارهای پایه ای RL و RC)
  • THE RLC CIRCUIT (مدارهای RLC)
  • SINUSOIDAL STEADY-STATE ANALYSIS (تحلیل حالت دائمی سینوسی)
  • AC CIRCUIT POWER ANALYSIS (تحلیل توان مدارهای AC)
  • POLYPHASE CIRCUITS (مدارهای چندفاز)
  • MAGNETICALLY COUPLED CIRCUITS (مدارهای با تزویج مغناطیسی)
  • COMPLEX FREQUENCY AND THE LAPLACE TRANSFORM (فرکانس مختلط و تبدیل لاپلاس)
  • CIRCUIT ANALYSIS IN THE s-DOMAIN (تحلیل مدار در حوزه S)
  • FREQUENCY RESPONSE (پاسخ فرکانسی)
  • TWO-PORT NETWORKS (شبکه های دو قطبی)
  • FOURIER CIRCUIT ANALYSIS (تحلیل فوریه)
  • تمرین های موجود در وب سایت



یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:19
0 نظر

Adhesion Strength at the Shotcrete–Rock Contact in Rock




یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:18
0 نظر

خلاصه کل معدنکاری زیرزمینی با ذکر تمامی روش های موجود ، مثال و ...

خلاصه کل معدنکاری زیرزمینی با ذکر تمامی روش های موجود ، مثال و ...

خلاصه کل معدنکاری زیرزمینی با ذکر تمامی روش های موجود ، مثال و ...

خلاصه معدنکاری زیر زمینی در 9 فایل بصورت جداگانه و با کیفیت عالی و شکل های رسم شده با حل مثال و ... بوده که زمان زیادی برای درست کردن آن صرف شده است 




یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:18
0 نظر

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim up در زمان های مختلف

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim up در زمان های مختلف

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim up در زمان های مختلف

چکیده

یکی از علت های شکست و عدم موفقیت در تکنیک های کمک باروری(ART) قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی است، که ممکن است با انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد به وجود آید. لذا در این مطالعه میزان قطعه قطعه شدن و آپوپتوز DNA اسپرم انسانی بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوباسیون به وسیله تست SCD و تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.در این مطالعه آینده نگر، بیست ویک نمونه ی اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. برای بررسی مورفولوژی اسپرم از رنگ آمیزی Papanicolaou و قابلیت حیات اسپرم از رنگ آمیزی Eosin-Nigrosin استفاده شد. نمونه ها در دمای 37 درجه سانتی گراد بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوبه شدند. قطعه قطعه شدن DNA در فواصل زمانی مختلف (3،2،1،0 ساعت) با استفاده از تست SCD مورد بررسی قرار گرفت. اسپرم های دارای هاله بزرگ و متوسط، DNA سالم داشتند و اسپرم هایی که دارای هاله کوچک و بدون هاله بودند DNA قطعه قطعه شده داشتند. میزان آپوپتوز نیز به وسیله تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.میانگین مورفولوژی نرمال و حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up 53/2±33/72 و 02/1±10/90 بوده است. میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به میزان معنی داری افزایش یافت بعد از دو ساعت (935/0±81/8، 004/0 P=) و بعد از سه ساعت (894/0±76/10، 0001/0 P=) انکوباسیون نسبت به زمان صفر (809/0±38/4) بوده است. همچنین میزان آپوپتوز DNA اسپرم در زمان دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر (864/0±19/9، 008/0 P=) و نیز زمان سه ساعت نسبت به زمان یک ساعت ( 7/0±97/10، 002/0 P=) انکوباسیون معنی دار شده است.در نهایت نتیجه ای که ما به آن دست یافته ایم نشان می دهد که انکوباسیون اسپرم نرمال در دمای 37 درجه سانتی گراد که به روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک های کمک باروری (ART) باید زمانی کمتر از دو ساعت باشد.

واژه های کلیدی:اسپرم نرمال، قطعه قطعه شدن DNA، انکوباسیون، تست SCD، تکنیک TUNEL

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول- مقدمه1

1-1- روش های کمک باروری2

1-2- ناباروری5

1-3- تولید اسپرم 5

1-4- مایع انزالی6

1-4-1- آنالیز مایع انزالی7

1-5- پارامترهای اسپرم10

1-5-1- مورفولوژی10

1-5-2- تحرک اسپرم12

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم 14

1-5-4- قابلیت حیات اسپرم14

1-5-5- حجم15

1-5-6- غلظت16

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن18

1-6-1- نکروز18

1-6-2- آپوپتوز سلولی18

1-6-2-1 مراحل آپوپتوز 19

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز21

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز21

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز .................................................................................................................23

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول .....................................................................23

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول............................................................24

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی ............................................................................................................24

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی ........................................................................................................25

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی..........................................................................................25

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس..........................................................................25

1-7- منشاءآسیب DNA اسپرم........................................................................................................................26

1-7-1- بستهبندیغیرطبیعیکروماتین.........................................................................................................27

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ....................................................................................28

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم...........................................................................................................28

1-9- نقشآپوپتوزدرآسیب DNA اسپرم.....................................................................................................29

1-10- استرساکسیداتیوبهواسطه ROS......................................................................................................30

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری.......................31

1-11-1- مصرف سیگار.........................................................................................................................................31

1-11-2- مواجهات شغلی.....................................................................................................................................32

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی................................................................................................33

1-11-4- سن...........................................................................................................................................................33

1-12- تکنیک­های بررسی ساختار کروماتین....................................................................................................33

1-12-1- روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان.................................................................................34

1-12-1-1- تست TUNEL...............................................................................................................................35

1-12-1-2- روش DBD-FISH.......................................................................................................................35

1-12-1-3- روش Comet...................................................................................................................................36

1-12-1-4- رنگ­آمیزی CMA3........................................................................................................................36

1-12-1-5- تکنیک SCSA................................................................................................................................37

1-12-1-6- تست SCD......................................................................................................................................37

1-12-1-7- رنگ­آمیزی آکریدین اورانژ39

1-12-1-8- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو................................................................................................................39

1-13- روش مهاجرت اسپرم..................................................................................................................................39

1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت...................................................................................................................40

فصل دوم- مواد و روش ها.......................................................................................................................................41

2-1- مواد و وسایل مورد نیاز.................................................................................................................................42

2-1-1- وسایل مورد نیاز...........................................................................................................................................42

2-1-2- مواد مورد نیاز...............................................................................................................................................42

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز........................................................................................................................45

2-2-1- ساخت محلول Hams F10...................................................................................................................45

2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)..................................................46

2-2-3- ساخت محلول تانل......................................................................................................................................46

2-2-4- ساخت محلول (PBS)...............................................................................................................................46

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین...................................................................................................................47

2-2-6- ساخت رنگ رایت.........................................................................................................................................47

2-3- روشها....................................................................................................................................................................48

2-3-1- روش جمع آوری اسپرم............................................................................................................................. 48

2-3-2- آنالیز مایع انزالی.......................................................................................................................................... 48

2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی..........................................................................................................................48

2-3-2-1-1- ظاهر....................................................................................................................................................48

2-3-2-1-2- آبکی کردن..........................................................................................................................................48

2-3-2-1-3- حجم....................................................................................................................................................48

2-3-2-1-4- چسبندگی..........................................................................................................................................48

2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی.........................................................................................................................49

2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون......................................................................................................................................50

2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم..........................................................................................................................50

2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ...............................................50

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک....................................................................................................................................51

2-3-2-2-3-1- روش کار........................................................................................................................................52

2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات........................................................................................................................53

2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین.................................................................................53

2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی..............................................................................................................................54

2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا..................................................................................................................54

2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن.......................................................................................................................54

2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا.........................................................................................................55

2-3-3- Direct swim-up.......................................................................................................................................57

2-3-3-1- روش کار....................................................................................................................................................57

2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD).....................................................................58

2-3-4-1- روش کار...................................................................................................................................................58

2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل.................................................................................................................................60

2-3-6-آنالیز آماری....................................................................................................................................................62

فصل سوم- نتایج...........................................................................................................................................................63

3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم....................................64

3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم......................67

3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم..........................68

3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم...............................................................................................................................................................................70

3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم..............................................................................................72

3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم..............................................................................................................................75

3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم..........................................78

3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم.............................................................................79

3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم..................................................80

3-10- نتایج کلی......................................................................................................................................................80

فصل چهارم- بحث....................................................................................................................................................81

4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم.............................................83

4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم...................................................................................................................................84

4-3- پیشنهادات.......................................................................................................................................................90

منابع

چکیده انگلیسی

فهرست شکل ها

عنوان صحنه

1-1- ساختار اسپرم انسانی......................................................................................................................................9

1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337

1-3- تست SCD....................................................................................................................................................38

2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون..........................................................................................................................50

2-2-MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود......................................................51

2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER .................................................................................................52

2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور.............................................................57

3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم..................................67

3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا..................................................................................................................................69

3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد..........................................74

3-4- رنگ آمیزی TUNEL..................................................................................................................................76

فهرست جدول ها

عنوان صفحه

1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO).......................................................................................................................................................17

2-1- ساخت Hamsf10......................................................................................................................................45

2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا..........................................................................................55

3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ..............................................................71

3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم............................................77

3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.........................................77

3-4- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم..........................................78

3-5- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم............................................................................79

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

3-1- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up66

3-2- مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up68

3-3- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up70

3-4- مقایسه میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش Swim-up73

3-5- مقایسه میانگین آپوپتوز اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش Swim-up...............................................................................................................................................................76

فصل اول

مقدمه

1-1- روش های کمک باروری

امروزه استفاده از روش های کمک باروری ([1]ART) بهترین گزینه برای رفع مشکلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت کامل تخمک و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوجهادارد. بنابراینآسیب DNA اسپرمیکاختلالژنومیاستکهبهمیزانمتفاوتدرمردانناباروروجود دارد. اززمانیکهاولینگزارشدرموردآسیب DNA اسپرممنتشرشدمطالعاتوسیعیدراینزمینهانجامگرفتهومشخصشدهکه درافراددارایمیزانبالایآسیب DNA، پارامترهایاسپرمیپایین می آیدوقدرتبارورینیزکاهشمی یابد.

از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریک تخمک­گذاری و روش IUI[2] (انتقال اسپرم متحرک و شسته شده به رحم) از جمله روش­های رایج درمانی بوده و هستند. لیکن این اقدامات تنها برای گروهی از زوج­های نابارور مؤثر است. این در حالی است که روش­های جدیدی از جمله IVF[3] و ICSI[4] امروزه به عنوان گزینه­هایی مناسب در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.

میزانموفقیتART بهسلامتوبلوغ گامتهایزوجینوابستهاست . طیلقاحطبیعیوروشلقاح آزمایشگاهیIVF احتمالنفوذ اسپرماتوزوایغیربالغوناسالمبهداخلتخمکتوسطسد زوناپلوسیدابهحداقلمیرسددرصورتیکهدرروش میکرواینجکشنیاتزریقمستقیماسپرمبهداخلسیتوپلاسم تخمک ICSI اینسدوجودنداشتهوایمنبودن روش ICSI همیشهموردنگرانیبودهاست . درضمن تحقیقاتنشاندادهاستکهانتخاباسپرمباپارامترهای معمولی (غلظت،مورفولوژی،تحرک) نمیتواندگویای سلامت DNA اسپرمباشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007). به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).

یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI) می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.

در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.

یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).

مطالعاتبیانگراینمطلباستکهدرتخمکهایلقاح یافتهبااسپرمهایدارایآسیببالای DNA، میزانلانهگزینی وبارداریبهطورمعنیداریکاهشمییابد . اگرچهژنوم آسیبدیدهپدری،طیرشدجنینیمیتوانددستخوش پردازشقرارگیرد،ولیدرصورتوجودآسیبهایزیاد، احتمالکاهشرشدجنینوجودداشتهواگرمیزاننقصها کمترباشد،میتواندنقایصبعدازتولدرابههمراهداشته باشد. بههمیندلیل،دردستهایازبیماران،نوزادانمتولد شدهتوسطروش ICSI داراینقصژنتیکیبیشترینسبتبه نوزادان طبیعیهستند .لازمبهذکراستکهتحقیقاتمتعدددر اینزمینه،نتایجضدونقیصیراگزارشکردهاند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

تجربیاتبهدستآمدهازروشهایکمکبارورینشان میدهد،چنانچهاسپرمبامیزانبالاییازآسیب DNA، در روند IVF و ICSI واردتخمکشودسیستمترمیمیتخمک ممکناستتواناییترمیماینآسیبهارانداشتهودر بسیاریازمواردباوجودموفقیتدرلقاح،سلولهایجنسی تواناییتشکیلجنینیاادامهتکاملراتامرحلهبعداز4تا8 سلولیکهمصادفبافعالشدنژنوماست،ندارند . براساس تحقیقاتمشخصشدهکهتواناییترمیمتخمکوابستهبه سنمادربودهوتخمکهایافرادجوان،ازقدرتترمیم DNA بالاییبرخوردارند. به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند که ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشکیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معکوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).

پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).

بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).

1-2- ناباروری[5]

ناباروری به معنای عدم توانایی برای بچه دار شدن، بعد از یکسال مقاربت بدون جلوگیری می باشد. حدود 15-10 درصد در سنین باروری خود، با این مشکل مواجه می باشند. عدم برخورد صحیح با مسئله ناباروری می تواند منجر به بروز مشکلات روحی، روانی و اجتماعی گردد. طیف وسیعی از عوامل زنانه و مردانه در ناباروری نقش دارند. حدود50 درصد موارد ناباروری مربوط به فاکتورهای مردانه است و تقریباً 15-10 درصد موارد ناباروری علت نا مشخص دارد. علل ناباروری مردان شامل طیف وسیعی از عوامل وراثتی، هورمونی، محیطی، فیزیولوژیک، مواد سمی و داروئی می باشد که سبب بروز علائمی چون عدم تولید اسپرم، تعداد بسیار کم یا کیفیت بد اسپرم های تولید شده می گردد(Agarwal & Said, 2003).

1-3- تولید اسپرم

تولید مثل جنسی شامل الحاق گامت نر و ماده است. منشاء مشترک اسپرم و تخمک، سلول های جنسی اولیه[6] است. در انسان وسایر پستانداران، سلول های جنسی اولیه در حدود هفته پنجم جنینی از کیسه زرده مشتق می شوند و با مهاجرت خود از طریق آلانتوئیس به آندودرم روده خلفی رفته و به دنبال آن وارد مزانتر پشتی شده و در نوار های تناسلی موجود در سمت پشتی جنین جای می گیرند. طناب های جنسی در دوران جنینی شکل می گیرند، در جنس نر هنگام تولید این طناب ها توپر بوده و دارای دو نوع سلول جنسی و غیر جنسی می باشند. سلول های جنسی دارای هسته ای بزرگ و روشن به همراه یک یا چند هستک است که بزرگتر از سلول های غیر جنسی می باشند. این سلول ها که اسپرماتوگونی[7] نوع A خوانده می شوند از تقسیمات میتوزی سلول های جنسی اولیه بوجود می آیند و بر روی غشاء پایه طناب های جنسی[8] قرار دارند. سلول های غیر جنسی کوچک تر می باشند و در اوایل دوران جنینی تکثیر یافته و سلول های سرتولی[9] (پشتیبان) را می سازند. با آغاز سن بلوغ، در پاسخ سیگنال های هیپو تالاموسی، سرعت تکثیر و تمایز این سلول ها بالا می رود و پس از مراحلی، به اسپرم بالغ تبدیل می شوند. مراحلی که موجب تکثیر سلول های اسپرماتوگونی، میوز و تغییرات مورفولوژیک آنها و در نهایت تبدیل اسپرماتوگونی به اسپرماتوزوئید می شود را اسپرماتوژنز[10] گویند (Guyton & Hall, 2006).

1-4- مایع انزالی[11]

مایع انزالی انسان حاوی پلاسمای سمینال، اسپرماتوزوئید ها و ترکیبات دیگر می باشد. حجم آن در افراد متغییر است. پلاسمای سمینال از ترشحات غدد لیتر[12]، وزیکول سمینال، کوپر، پروستات، اپیدیدیم و آمپولا تشکیل شده است. در حین انزال اسپرم از انتهای اپیدیدیم و مجاری دفران با ترشحات غدد ضمائم جنسی مخلوط می شود.

ابتدا ترشحات غدد لیتر وکوپر، سپس ترشحات آمپول و اپیدیدیم تخلیه شده و سرانجام بخش اعظم مایع انزالی در انسان (حدود70 درصد) از ترشحات وزیکول سمینال حاوی مواد فعال کننده اسپرماتوزوئید ها مانند فروکتوز، سیترات، اینوزیتول، پروستاگلاندین ها و چندین پروتئین و تعدادی عناصر معدنی و مواد آلی می باشد. پلاسمای سمینال بخش اعظم سیمن انسان را تشکیل می دهد. ترکیبات پلاسمای سمینال ممکن است در انقباض بافت های مجرای دستگاه تولید مثل زن و در نتیجه تسهیل انتقال اسپرم موثر باشد. مایع سیمن دارای 5/7PH= است که علت آن ترشحات قلیائی پروستات است که علاوه بر خنثی کردن اسیدیته مختصر مایعات سیمن، خاصیت قلیائی مختصری به آن داده و باعث ظاهر شیری رنگ آن می شود. مایع پروستات همچنین دارای آنزیم منعقد کننده است که با اثر بر فیبرینوژن موجود در مایع سمینال وزیکول باعث شکل گیری لخته فیبرینی ضعیفی می شود که سیمن را در قسمت های عمقی واژن در مجاورت گردن رحم نگه می دارد و ظرف 30-15 دقیقه تحت تأثیر فیبرینولیزین حل می شود. هرچند نقش دقیقی برای پلاسمای سمینال شناخته نشده است ولی بعنوان محیطی برای انتقال اسپرم در دستگاه تناسلی مرد عمل می کند و همچنین شرایط قلیائی و غذائی برای زنده ماندن اسپرم در محیط اسیدی واژن فراهم می نماید(Guyton & Hall, 2006).

نمونه سیمن طبیعی ظرف 60-30 دقیقه در در جه حرارت اتاق به حالت محلول در می آید. در بعضی نمونه ها محلول شدن کامل در عرض 60 دقیقه اتفاق نمی افتد. وجود تکه های موکوس یک عامل مهم در این امر است. لوله سیمن نرمال حاوی تکه هایی شبیه ژله می باشند (اجسام ژلاتینور) که محلول، مایع نمی شود. علت این امر به طور کامل مشخص نیست. گاهی می توان به نمونه ای که مایع نمی شود موادی اضافه کرد مانند برومیلن یا پلاسمین که در این صورت برای آزمایش آماده می باشد.

1-4-1- آنالیز مایع انزالی

به علت عدم وجود یک تست آزمایشگاهی برای پیشگویی قطعی پتانسیل باروری در مردان، آنالیز مایع انزالی (SA[13]) اولین تست مورد استفاده برای پیش بینی قدرت باروری مردان می باشد. قبل از گرفتن نمونه انزال، به بیمار آموزش داده می شود تا از عمل انزال به مدت 3-2 روز پرهیز نماید. حجم مایع انزالی، غلظت اسپرم و تعداد اسپرم، به طور مداوم طی 10 روز پرهیز جنسی افزایش می یابد. انزال مکرر ممکن است همراه با کاهش حجم مایع انزالی و کاهش تعداد کلی اسپرم های متحرک باشد. در حالیکه انزال با دفعات کمتر، با کاهش اسپرم های دارای مورفولوژی طبیعی همراه بوده است(Nallella, Sharma, Aziz, & Agarwal, 2006). سازمان بهداشت جهانی ([14]WHO) استفاده از پروتکل استانداردی را جهت ارزیابی مایع سمینال پیشنهاد کرده و طبق این پروتکل، هر نمونه از نظر پارامترهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی مورد ارزیابی قرار می گیرد. برای انجام آنالیز، نمونه انزال افراد معمولاً به روش خود انزالی[15] جمع آوری می شود. این روش نمونه گیری نسبت به نمونه گیری سمین از طریق مقاربت فواید زیادی دارد از جمله می توان به اجتناب از تأثیر حرارت، تسریع در انجام و عدم آلودگی با ترشحات دستگاه تولید مثل زن اشاره کرد. حدود 15 درصد بیمارانی که از لحاظ پروتکل استاندارد WHO نرمال و دارای اسپر موگرام[16] طبیعی هستند، یعنی مایع سیمن آن ها از لحاظ ماکروسکوپی (سیالیت، ظاهر، حجم، ویسکوزیته و PH) و میکروسکوپی (تعداد اسپرم، تحرک، آگلوتیناسیون، مورفولوژی، میزان زنده بودن و حضور یا عدم حضور سلول های غیر اسپرمی) نرمال است، دارای مشکل ناباروری می باشند و بالعکس در مردان با آنالیز سیمن غیر طبیعی، موارد باروری هم مشاهده شده است. بنابراین آنالیز مایع سیمن برای شناسائی دقیق نقایص اسپرمی موجود در بیماران با فاکتورهای نا باروری مردانه کافی نیست و انجام تست های تکمیلی ضروری می باشد(Nallella, et al., 2006).

1-1- ساختار اسپرم انسانی

1-5- پارامترهای اسپرم

1-5-1- مورفولوژی[17]

یکی از پارامترهای مهم آنالیز اسپرم مورفولوژی است (Ichimura, et al., 1995). در واقع استاندارد کردن مورفولوژی اسپرم روش بسیار مشکلی است، زیرا طیف مورفولوژی بسیار وسیع است. طبقه بندی های زیادی در زمینه مورفولوژی اسپرم انجام شده که کار دشواری است. زیرا هر کدام طیفی از طبقه بندی استاندارد را مشخص می کند، در زمینه مورفولوژی اسپرم دو سوال مهم مطرح می باشد :مورفولوژی نرمال کدام است؟ مورفولوژی غیر طبیعی چه تاثیری در قدرت باروری اسپرم دارد؟

تقسیم بندی قدیمی شکل طبیعی اسپرم را بیضی شکل معرفی می کند که دارای سر به ابعاد 5×5/2 میکرون است و حدود 70 درصد قدامی سر توسط آکروزوم یکنواخت پوشانده شده، در ضمن دارای گردن سالم و بدون نقائص آناتومیکی با دم دراز و کشیده می باشد. ولی تقسیم بندی Strict بر مبنای تعداد اسپرم موجود در موکوس کانال اندروسرویکس بعد از نزدیکی استوار است(Isachenko, Isachenko, Katkov, Dessole, & Nawroth, 2003). برخی محققین دسته ای از اسپرم های یکنواخت را در کانال اندروسرویکس یافتند که از نظر بیولوژی برای باروری انتخاب شده بودند. محدوده های مورفولوژی طبیعی با مقایسه ی این اسپرم ها با لقاح خارج رحمی مشخص شد. مورفولوژی فقط به عنوان یک اصل فرعی برای باروری تلقی می شود و یک عامل تعیین کننده ی باروری در مقابل ناباروری است.

تمامی نمونه های سیمن دارای در صد خاصی از اسپرم های غیر طبیعی هستند. ناهنجاری های مورفولوژیک ممکن است شامل ناهنجاری های سر، قطعه میانی و یا دم اسپرم باشند. ناهنجاری های سر اسپرم همراه با نازایی هستند. پیشنهاد کرده اند که مورفولوژی اسپرم ممکن است پیشگویی کننده لقاح موفقیت آمیز خارج رحمی باشد (McLaughlin, Ford, & Hull, 1992). مورفولوژی اسپرم با قدرت باروری ارتباط دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم یک شاخص حساس کیفیت اسپرماتوژنز و باروری است. وجود نقایص مورفولوژیکی می تواند با فعالیت نرمال اسپرم مغایرت داشته باشد. این نقایص می تواند در جلوگیری از عبور اسپرم از موکوس سرویکس، باند شدن اسپرم با زوناپلوسیدا و واکنش آکروزومی نقش داشته باشد. گاهی افراد با تعداد طبیعی اسپرماتوزوئید نابارور می باشند. در چنین حالتی گاهی دیده می شود که تا 100 درصد اسپرم ها از نظر مورفولوژی غیر طبیعی هستند. مثلا: دو سر، سر غیر طبیعی و یا دم غیر طبیعی دارند. در موارد دیگر اسپرم از نظر ساختمانی کاملا طبیعی به نظر می رسد اما به دلایلی، کاملا بی حرکت یا نسبتا بی حرکت است. هر گاه قسمت اعظم اسپرماتوزئید ها از نظر شکل غیر طبیعی باشند و یا فاقد حرکت باشند با وجودی که اسپرماتوزوئیدها شخص طبیعی به نظر می رسند ولی احتمال ناباروری وجود دارد. بر اساس مطالعات اپیدمیولوژی کمترین حد مورفولوژی طبیعی اسپرم برای حاملگی طبیعی 30 درصد در نظر گرفته می شود. اسپرماتوزوئید پستانداران مختلف از نظر شکل ظاهری با هم متفاوت می باشند. در همه پستانداران، اسپرم از سه قسمت اصلی سر[18]، بخش میانی[19] و دم[20] تشکیل شده است. هر سه قسمت توسط غشای پلاسمایی پوشانده شده اند. غشا پلاسمایی ساختمان پوسته ای است که در انتقال مواد غذایی به داخل سلول نقش فعال دارند. قسمتی از غشای پلاسمایی که سطح قدامی سر اسپرم را می پوشاند در ارتباط با واکنش آکروزومی عمل می نماید. این عمل بعد از ظرفیت یابی و قبل از نفوذ به ناحیه شفاف اطراف تخمک صورت می گیرد(Hashemi, Karami‐Tehrani, Ghavami, Maddika, & Los, 2005). بخش عمده سر، حاوی هسته با کروموزم های هاپلوئید است. هر کروموزوم حاوی DNA است که با پروتئین های پروتامین پیچیده شده است. پروتامین نقش عمده ای در تراکم DNA اسپرم دارد. این متراکم شدن باعث کاهش حجم اسپرماتوزوئید جهت تسهیل انتقال در دستگاه تناسلی ماده و به حداقل رسیدن آسیب به DNA اسپرم می شود. دو سوم جلوی سر اسپرم دارای ساختمان کلاهک مانندی به نام آکروزوم است که از دستگاه گلژی مشتق می شود. آکروزوم دارای آنزیم های هیدرولیتیکی از جمله هیالورونیداز، اسید فسفاتاز و نورآمینیداز می باشد که برای انجام واکنش آکروزومی و جهت نفوذ اسپرم به پوشش خارجی محاط کننده دور تخمک ضروری است. بخش میانی اسپرم حاوی میتوکندری است که ATP[21] لازم برای حرکت دم و در نتیجه حرکت اسپرم و حفظ تعادل اسمزی را تولید می کند. در بخش دم که تاژک نامیده می شود، نیروی حرکتی لازم برای رسیدن اسپرم به تخمک و نفوذ به داخل زوناپلوسیدا[22] را فراهم می کند. این تحرک ناشی از حرکات موجی شکل تاژک است که از انرژی بیوشیمیایی ATP حاصل می گردد و با تبدیل انرژی جنبشی باعث روی هم لغزیدن میکروتوبول های موجود در تاژک و تحرک اسپرم شود(Hashemi, et al., 2005).

1-5-2- تحرک[23] اسپرم

یک پارامتر مهم در آنالیز مایع سیمن، تحرک اسپرم است که به صورت درصد اسپرم های دارای تحرک پیشرونده در مایع انزال تعریف می شود. تحرک پیشرونده، در واقع با محاسبه حرکت سریع (a) به اضافه حرکت کند (b) به دست می آید. تعداد کل اسپرم های متحرک، با محاسبه تحرک پیشرونده به اضافه حرکت غیر پیشرونده ( درجا) محاسبه می شود. WHO و اکثر آزمایشگا ه ها از تحرک 50 درصد بعنوان حد پایین طبیعی استفاده می کنند. با وجود این، انجمن تکنولوژی باروری، تحرک به میزان 40 درصد را به عنوان معیاری برای تعریف ناباروری ناشی از فاکتور مردانه قبول دارد. به این ترتیب حد پایین طبیعی، تغییرات بارزی را نشان می دهد و بستگی به تجربه آزمایشگاه منطقه دارد. بطور کلی مردان با تعداد اسپرم متحرک بیشتر از 10 میلیون در هر میلی لیتر، نسبت به آن هایی که 2 تا 10 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر دارند، میزان باروری بالاتری دارند. تحرک اسپرم ناشی از حرکات موجی شکل تاژک است که از تبدیل انرژی بیوشیمیایی ATP به انرژی جنبشی ناشی می گردد و به سبب روی هم لغزیدن میکروتوبول های موجود در تاژک می شود. در اسپرماتوزوئیدهای انسان ناهنجاری های عناصر مختلف تاژک، باعث اختلال در تحرک می شود و بر اساس نقص در ساختمان آکسونم و یا پیش آکسونم[24] تقسیم بندی می شود. حرکت نفوذی اسپرم برای عبور از موکوس گردن رحم و نفوذ به لایه شفاف تخمک ضروری به نظر می رسد.

اسپرم های حاصل از انزال دارای سرعت های مختلف بوده و تحت تاثیر فاکتورهای متعددی می باشند. مثلا اگر ویسکوزیته مایع سمینال زیاد باشد یا درجه حرارت محیط اسپرم کاهش یابد، تحرک اسپرم کاهش می یابد(Leist & Nicotera, 1998). رادیکال های آزاد اکسیژن (ROS[25]) می تواند با آسیب به ساختمان تاژک سبب کاهش تحرک اسپرم شوند یا مثلا واریکوسل باعث افزایش حرارت کیسه بیضه شده و سبب کاهش اسپرماتوژنز و تجمع ترکیبات فرعی متابولیک می شود که باعث کاهش بیشتر تحرک و افزایش مورفولوژی غیر عادی و کاهش عملکرد سلول های بینابینی می گردد(Agarwal & Said, 2003). با کمک روش های رنگ آمیزی مناسب مشخص شده که وجود اسپرم های غیر متحرک به مفهوم مرگ این سلول ها نمی باشد. بدنبال مقاربت، اسپرم ها را می توان بین 5/1-3دقیقه پس از انزال، در موکوس گردنه رحم جستجو کرد. و حدود دو ساعت پس از مقاربت اسپرماتوزوئیدها خود را به لوله رحم می رسانند.

کاهش تحرک اسپرم با عنوان آستنوزوسپرمیا[26] خوانده می شود. این عارضه توسط عواملی ایجاد می شود که عبارتنداز : واریکوسل[27]، عدم انزال طولانی مدت، اختلال های بیوشیمیایی یا ساختمانی اجزای اسپرم و اپیدیدیم و آنتی بادی های ضد اسپرم(Kroemer, Petit, Zamzami, Vayssiere, & Mignotte, 1995). بسیاری از مراکز میزان تحرک اسپرم را طبقه بندی کرده اند که از بی تحرک تا حرکت سریع روبه جلو متغیر است. گرچه امروزه در آزمایشگاه های پیشرفته از تکنولوژی [28]CASA برای بررسی کلنیکی حرکت اسپرم استفاده می کنند اما روش مرسوم ، بررسی میکروسکوپی در آزمایشگاه است.

1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم

سازمان بهداشت جهانی اسپرم ها را از نظر تحرک به 4 دسته تقسیم کرده است که شامل :

الف- حرکت سریع و پیشرونده در مسیر مستقیم (نوعa )[29] : اگر اسپرمی چهار برابر اندازه سر به جلو حرکت کند ( حدود 25 میکرو متر در ثانیه) آن را دارای حرکت سریع می دانیم (اندازه سر اسپرم حدود 5-4 میکرون طول دارد).

ب- حرکت روبه جلو پیشرونده آهسته (نوعb)[30]: اگر اسپرم سریع از جلوی چشم ما دور نشود، یعنی حدود 15 میکرو متر در ثانیه حرکت داشته باشد دارای حرکت آهسته است.

ج- دارای تحرک اما بدون الگوی پیشرونده (نوع c)[31] : اگر اسپرم، متحرک باشد ولی هیچگونه پیشرفتی به جلو نداشته باشد دارای حرکت درجا است.

د- فاقد تحرک (نوع d) : چنین اسپرمی ثابت است و هیچ حرکتی ندارد(Brotherton, 1990).

1-5-4- قابلیت حیات [32] اسپرم

قابلیت حیات اسپرم و میزان هیپواسمولاریتی، توسط ساختمان غشاء اسپرم و عملکرد آن تعیین می شود. اسپرم زنده با غشاء سالم اجازه عبور برخی رنگ ها مانند ائوزین و تریپان بلو را به داخل سیتوپلاسم نمی دهد. بنابراین در مقابل زمینه تاریک، سفید به نظر می رسد. اسپرمی که ساختمان غشای آن نقص داشته باشد، نمی تواند از نفوذ رنگ به داخل خود جلوگیری کند لذا سیتوپلاسم آن به رنگ صورتی یا آبی دیده می شود. بنابراین کل ساختمان غشایی به وسیله آزمایش قابلیت حیات اسپرم اندازه گیری می شود(S. Howell & S. Shalet, 2001; S. J. Howell & S. M. Shalet, 2001). اندازه گیری قابلیت حیات اسپرم مهم است، زیرا باعث جداسازی نمونه های نکرواسپرمیک از نمونه های اسپرم زنده ولی بدون تحرک می شود. قابلیت حیات اسپرم با میزان باروری ارتباط دارد(Botchan, et al., 1997). قابلیت حیات اسپرم ها معمولا در نمونه هایی که درصد اسپرم های بی تحرک در آن ها بیش از 50 درصد است انجام می شود (Sakkas, Mariethoz, & St John, 1999). بنابراین برای شناسایی اسپرم های زنده از مرده، در نمونه های آستنو اسپرمی که درصد اسپرم های بی تحرک بیش تر است از این تست استفاده می شود (Mahadevan & Trounson, 1983).

1-5-5- حجم[33]

حجم نرمال مایع انزالی بر اساس معیار WHO بیشتر از 2 میلی لیتر می باشد و از فردی به فرد دیگر متغیر می باشد. اگر حجم انزال کمتر از 1 میلی لیتر باشد فرد هیپواسپرمی[34] و اگر حجم انزال بیش از 6 میلی لیتر باشد، به آن هیپراسپرمی[35] می گویند. غالبا حجم خیلی کم مایع سمینال (کمتر از 1 میلی لیتر) همراه با شمارش پایین و در حجم زیاد (بیش از 6 میلی لیتر)، تعداد اسپرماتوزوئیدها کمتر از حد نرمال است که ممکن است ناشی از یک دوره طولانی مدت اجتناب از انزال، یا تولید زیاد مایع سمینال باشد. غالبا قسمت ابتدایی انزال حاوی تعداد زیادی اسپرماتوزوئید است و ترشحات وزیکول سمینال که 70 درصد انزال را شامل می شود، قسمت دوم انزال را تشکیل می دهد. اگر فرد فاقد مایع انزالی باشد به آن آسپرمی[36] گویند. حجم نمونه را می توان از روی ظروف نمونه گیری توسط کشیدن نمونه به داخل پیپت دهانه گشاد اندازه گیری کرد. چنانچه قرار باشد سیمن در محیط کشت قرار گیرد یا برای لقاح خارج رحمی استفاده شود یا برای مطالعات بیولوژیک بکار رود، باید با ظروف استریل حمل و نقل شود(Hashemi, Karami-Tehrani, & Ghavami, 2004).

1-5-6- غلظت[37]

یکی از فاکتور های مهم آنالیز سیمن، تعیین تعداد اسپرم در هر میلی لیتر انزال است. غلظت اسپرم ممکن است با استفاده از روش هموسیتومتر یا روش بکارگیری حفره ویژه شمارش اسپرم اندازه گیری شود که روش هموسیتومتر مرسوم تر است. هر چند گستره تعداد اسپرم برای افراد بارور بین 120-60 میلیون در میلی لیتر است، اما طبق معیار WHO، افراد دارای بیش از 20 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر را جزء افراد بارور به حساب می آورند. به طور کلی از نظر تعداد اسپرم افراد را به چهار گروه تقسیم می کنند:

1- نرموزوسپرمی[38]: مایع انزالی دارای تعداد اسپرم طبق استاندارد WHO است(بیشتر از 20 میلیون در هر میلی لیتر انزال).

2- اولیگوزوسپرمی[39]: مایع انزالی دارای تعداد اسپرم کمتر از استاندارد WHO (کمتر از 20 میلیون در هر میلی لیتر انزال).

3-پلی زوسپرمی[40]: مایه انزالی دارای اسپرم بالا (بیشتر از 250 میلیون در هر میلی لیتر انزال).

4- آزوسپرمی[41]: عدم وجود اسپرم در مایع انزالی که می تواند به دلایل زیر باشد:

الف- وجود نقص در مسیر سنتز و ترشح گنادوتروپین

ب- فقدان اسپرماتوژنز در بیضه ها

ج- انسداد مجرا، حالتی که اسپرم فعال تولید می شود اما در بیضه ها محبوس بوده و راهی به خارج ندارد(WHO 2010).

جدول 1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)

خصوصیات مورد نظر مقادیر نرمال

حجم ml2

غلظت اسپرم ml106×20 یا بیشتر

کل تحرک اسپرم 106×40 اسپرم در هر انزال یا بیشتر

تحرک دارای 50 درصد یا بیشتر حرکت (a+b)*

25 درصد یا بیشتر حرکت a در طی60 دقیقه پس از انزال

قابلیت حیات دارای 50 درصد یا بیشتر اسپرم زنده

سلول های سفید کمتر از ml106×1

مورفولوژی 15 درصد اسپرم دارای شکل طبیعی یا بیشتر

*:a حرکت تند پیشرونده، :b حرکت آهسته پیشرونده

1-6- انواع مرگ سلولی و تعریف آن

مرگ سلولی از لحاظ مورفولوژیک به دو نوع تقسیم می شود : نکروز[42] و مرگ سلولی برنامه ریزی شده[43] یا آپوپتوز

1-6-1- نکروز

در نتیجه یک آسیب خارجی ایجاد شده گروهی از سلول ها را در برگرفته ونهایتاََ موجب از هم گسستگی غشاء سلول وتورم بافتی می شود. این امر موجب شروع پاسخ التهابی در بافتهای مجاور می گردد. اما آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده روی سلولهای منفرد اثر می گذارد و با التهاب بافتی ارتباطی ندارد (Kerr, Wyllie, & Currie, 1972).

1-6-2- آپوپتوز سلولی[44]

مدت کوتاهی پس از ارائه نظریه سلولی توسط Schleiden و Schwann در سال 1842، Carl Voget مرگ سلولی را در نوتوکورد وغضروف مجاور آن در نوعی وزغ که در حال دگردیسی بود، گزارش کرد. در پی آن کشفهای بیشتری از مرگ سلولی و مشاهده آن ارائه گردید (Clarke & Clarke, 1996). اگر چه ممکن است مرگ به عنوان نقطه مقابل حیات تصور شود، با دید زیست شناختی، مرگ بخش قابل انکار حیات در نظر گرفته می شود. بنابراین حضور یک سیستم پیشرفته برای برنامه ریزی مرگ، از جمله ویژگی های مشترک ارگانیسم های پیشرفته می باشد.

آپوپتوز، نوع خاصی از مرگ سلولی است، در نتیجه تمام مرگ های برنامه ریزی شده توسط آپوپتوز صورت نمی گیرد (Schwartz, Smith, Jones, & Osborne, 1993). آپوپتوز فرایند پیچیده ای است که برای اولین بار در سال 1972 توسط Kerr وهمکاران جهت توصیف مرگ فیزیولوژیک و تمایز آن از نکروز معرفی شد(Greenberg, 1996; Kerr, et al., 1972). آپوپتوز در رشد و نمو هموستازی ، در یوکاریوتهای چند سلولی نقش حیاتی دارد و نقش مهمی در کنترل سطح و اندازه سلول دارد و با فیزیولوژی نرمال ارتباط دارد. این فرایند از طریق سه مکانیزم فعال می شود(Greenberg, 1996):

1- از طریق سیگنال های درون سلول. 2- به وسیله اتصال فعال کننده ها به رسپتورهای سطح

سلول مثل TNF[45]، لنفوتوکسین[46]. 3- به وسیله رادیکال های اکسیژن

1-6-2-1- مراحل آپوپتوز

فرایند آپوپتوز را می توان به سه مرحله : القا ، اثرکننده و تجزیه تقسیم کرد. در خلال مرحله القا سلول محرک های گوناگون تحریک کننده مرگ را دریافت می کند. از جمله فقدان عامل بقای ضروری، کم شدن ذخیره متابولیک، اتصال لیگاند به گیرنده و انتقال دهنده پیام مرگ مانند CD95 وگیرنده TNF و یا آسیب توسط سموم، حرارت وتشعشع. از آن جا که رخدادهای بیوشیمیایی مرحله القا، به نوع محرک وابسته هستند، مسیری اختصاصی دارد. تنها در خلال مرحله بعدی که این حوادث آغاز کننده به الگوی منظمی از واکنش های متابولیک ترجمه می شوند و در چنین شرایطی است که تصمیم مرگ گرفته می شود. بنابراین، سرنوشت نهایی سلول در خلال مرحله اثر کننده تابع رخدادی تنظیمی است. در خلال مرحله تجزیه، آنتروپی کلی افزایش می یابد، آنزیم های کاتابولیک فعال شده و از اثرات تنظیمی بیشتر جلوگیری می شود و خرد شدن DNA، تجزیه وسیع پروتئین و مانند آن ظاهر می شود. مرحله اثر کننده را می توان مهمترین مرحله آپوپتوز دانست. زیرا در اثر بر هم کنش بین پروتئین های متفاوت مثل فعال شدن ژن های کشنده و اختلال در چرخه سلولی و تقسیم میتوز، سرنوشت سلول تعیین می شود(Kroemer, et al., 1995).

آپوپتوز بر خلاف نکروز دارای روند متوالی ومشخص می باشد. اصلی ترین ویژگی قابل قبول برای شناسایی آپوپتوز، تغییرات ریخت شناسی سلول است. از جمله تغییرات ریخت شناسی اولیه در یک سلول در حال آپوپتوز، متراکم شدن کروماتین و تغییر شکل آن به صورت اجسام هلالی شکل متراکمی است که در مجاور غشای هسته قرار می گیرد. حجم سلول کاهش یافته و چگالی آن افزایش می یابد. سیتوپلاسم متراکم شده و غشا هسته و سلول به شدت دندانه دندانه می گردد. سپس هسته قطعه قطعه شده تمامی سلول حالت وزیکولر به خود گرفته و به صورت قطعاتی در می آید که توسط غشا پوشیده شده است و اجسام آپوپتوتیک[47]نامیده می شوند. اندمک ها فشرده می شوند و تغییر در اندازه و فعالیت سلول آشکار می گردد.

در غشای سلول برآمدگی حباب مانندی ایجاد می گردد. غشای پلاسمایی پاره نمی شود بلکه به صورت چند گرانول کوچک در می آید که حاوی سیتوپلاسم متراکم و اندامک های دست نخورده آن می باشد که به آن اجسام آپوپتوتیک می گویند. اغلب اجسام آپوپتوتیک در شرایط in vivo بلافاصله توسط سلول های مجاور و ماکروفاژ ها بلعیده شده و توسط لیزوزم تجزیه می گردند. بنابراین پاسخ التهابی دیده نشده یا خیلی کم مشاهده می شود. در این فرایند سلول چروکیده شده وتغییرات هسته ای رخ می دهد. آنزیم های خاصی در سلول فعال شده شروع به تجزیه پروتئین و DNA می کنند. و نیز افزایش غلظت درون سلولی کلسیم که ناشی از خالی شدن منابع سلولی آن مانند شبکه آندوپلاسمی، دیده می شود. دهیدراتاسیون سلول، قرار گرفتن فسفاتیدیل سرین[48] در سطح غشا سلول، افزایش نفوذپذیری میتوکندری، آزاد شدن محتویات میتوکندری به درون سیتوپلاسم، از دست دادن پتانسیل غشا میتوکندری، پروتئولیز لامین B، دناتوره شدن[49]DNA و مشاهده DNA در سیتوپلاسم از دیگر علائم این پدیده می باشد. آپوپتوز معمولاََ در سلول های بالغ منفرد رخ می دهد(Hale, et al., 2004; Walker, 1998).

آپوپتوز مرگ فیزیولوژیک سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلول های پیر، آسیب دیده، اضافی و مضر می شود و برای تکامل و هموستاز بافتی ضروری است(Israels & Israels, 2000). هر گونه اختلال در این روند، منجر به بیماری می شود(Ghavami, et al., 2005)که می تواند ناشی از کاهش مرگ سلولی بوده و موجب ایجاد و رشد سلول های سرطانی و یا اختلال خود گردد. افزایش غیر طبیعی مرگ سلولی در بیماری هایی مثل اختلالات نرودژنراتیو و ایدز دیده می شود(Hashemi & Kroczak, 2005).

1-6-2-2 مسیر های آپوپتوز

مولکول های متعدد در فرایند آپوپتوز درگیر هستند. تحریک مولکول های پرو آپوپتوزی و یا مهار فاکتورهای آنتی آپوپتوزی بستگی به نوع سلول و محرک دارد. دو مسیر اصلی آپوپتوز، مسیر خارجی یا مسیر وابسته به گیرنده های مرگ[50] و مسیر داخلی یا مسیر میتوکندریایی می باشد(Hashemi & Kroczak, 2005; Yavin & Arav, 2007).

1-6-2-3- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز

گیرندهای مرگ: آپوپتوز از طریق تحریک چندین گیرنده سطح سلولی به وسیله فعالیت کاسپاز ها[51] شروع می شود.

تغییرات غشایی: در مراحل اولیه آپوپتوز در سطح سلول و غشا پلاسمایی تغییرات مهمی رخ می دهد. از جمله این تغییرات حرکت فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی غشا سلول به سطح خارجی آن است. این تغییر جزء وقایع زود هنگام آپوپتوز است و از سایر تغییرات مورفولوژیکی نظیر تجمع هسته و چروکیدگی سلول مقدم تر است. اما تمامیت غشا تا مراحل بعدی آپوپتوز دست نخورده می ماند.

آبشارهای پروتئازی: سیگنال های تحریک کننده ی آپوپتوز منجر به فعالیت خانواده ای از پروتئازهای سیستئین داخل سلولی می شوند. کاسپازها نقش محوری در شروع آپوپتوز بازی می کنند. اعضای مختلفی از کاسپازها در سلول های پستانداران شناخته شده اند. از مهمترین آن ها کاسپاز I یا ICE[52] می باشد که به عنوان یک پروتئاز سیستئینی مسئول عمل اینتر لوکین یک بتا می باشد. فعال شدن کاسپازها در نتیجه انتشار سیتوکرم C از میتوکندری به سیتوزول رخ می دهد.

تغییرات میتوکندریایی: فعالیت فیزیولوژیک میتوکندری ها از سلول هایی که تحت آپوپتوز یا نکروز قرار گرفته اند متوقف می شود. در طول آپوپتوز، نفوذپذیری میتوکندری تغییر می کند و فعال کننده های پروتئازی مخصوص آپوپتوز از آن ها منتشر می شوند. در مقدار میتوکندری های آپپتوتیک کاهش زیادی دیده شده است. منقطع شدن غشای خارجی میتوکندری، در نتیجه انتشار سیتوکروم C به سیتوزل و به دنبال آن دپلاریزه شدن غشای خاجی از وقایع قابل توجه در سلولی است که تحت آپوپتوز قرار گرفته. انتشار سیتو کروم C (Apaf-2) موجب فعال شدن کاسپاز ها می شود. ماده دیگری که از میتوکندری در جریان آپوپتوز به درون سیتوزول صادر می شود AIF[53] می باشد(Bowen, 1993). این ماده خاصیت تجزیه پروتئین را دارد وبرای تحریک آپوپتوز کافی است. مشاهده شده که DNA میتوکندری در مراحل ابتدایی آپوپتوز دست نخورده باقی می ماند واین می تواند در بررسی آپوپتوز و مقدار پیشرفت آن کمک کننده باشد.

قطعه قطعه شدن DNA: علامت بیولوژیک خاص آپوپتوز قطعه قطعه شدن DNA است، یک اتفاق تغییر ناپذیر که هنگام مرگ سلولی، قبل از تغییرات غشایی رخ می دهد.

قطعه قطعه شدن DNA با واسطه فعالیت اندونوکلئازهای درون سلولی وابسته به کلسیم ومنیزیم اتفاق می افتد. این آنزیم ها، DNA را در مناطقی که بین نوکلئوزوم ها قرار گرفته است می شکافند وقطعات یکسان DNA ایجاد می کنند. تراکم کروماتین: یکی از تغییرات زود هنگام در آپوپتوز متراکم شدن کروماتین در زیر غشای داخلی هسته می باشد. این فرایند می تواند با یک فلورو کروم پلی نوکلوئید خاص مانند "پرو پیدیوم یدید[54] و یا [55]DAPI" آشکار شود(Bowen, 1993).

قطعه قطعه شدن هسته: اتفاق دیگر آپوپتوز، متراکم شدن هسته است. این همان قطعه قطعه شدن هسته در مراحل کلیواژ، مورولا و یا بلاستوسیست است که کوچکتر از هسته های سالمند(Bowen, 1993).

قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم: درصد بسیاری از جنینهایی که به صورت in vitro رشد می کنند، درجات مختلفی از قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم در آن ها دیده می شود. این قطعات شبیه به اجسام آپوپتوتیک می باشند که در آن ها اندامک های سلولی مشاهده شده است. ظهور این قطعات همراه با افزایش اختلال کروموزومی بوده و پیش زمینه ای برای شروع آپوپتوز می باشد(Erenpreiss, et al., 2004).

1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز

جهت سنجش آپوپتوز و بررسی مکانیسم آن روش های متعددی بر مبنای تغییرات مورفولوژیک و بیو شیمیایی سلول های آپوپتوزی طراحی ومعرفی شده اند. مهمترین نکته ای که می بایست در نظر گرفته شود انتخاب درست تکنیک سنجش آپوپتوز بر مبنای نوع مطالعه (روی سلول یا بافت)، القاءکننده مورد نظر، مکانیسم مورد بررسی و سازگاری حساسیت و اختصاصی بودن نتایج بر مبنای تعداد سلول یا غلظت آنالیت مورد سنجش است. پدیده های بیو شیمیایی که در همه و یا اغلب سلول های آپوپتوزی رخ می دهد به تشخیص بهتر و واضح تر این پدیده در سلول ها کمک می کند. روش انتخابی جهت بررسی آپوپتوز به نوع سلول مورد نظر و هدف تحقیق بستگی دارد. برخی از این روش ها جهت نمونه کوچک مناسب بوده در حالی که برخی دیگر جهت آزمایشات گسترده با نمونه بزرگ به کار می رود(Bröker, Kruyt, & Giaccone, 2005).

1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول

فسفاتیدیل سرین، فسفو لیپدی است که به طور نرمال در سطح داخلی غشاء پلاسمایی قرار گرفته است. یکی از اولین وقایع در طی آپوپتوز خروج فسفاتیدیل سرین وقرار گرفتن آن در سطح سلول است.

این مسئله از دوجهت مهم می باشد: اول اینکه این تغییر معمولا مقدم بر سایر تغییرات مورفولوژی مانند تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و بر آمدگی غشاء و تشکیل اجسام آپوپتوزی می باشد. دوم اینکه فسفاتیدیل سرین یکی از مولکول های سطح سلول آپوپتوزی است که توسط ماکروفاژها شناسایی می شود و بنابراین نقش کلیدی در حذف سلول های مرده قبل از پاره شدن غشاء ان ها و بروز واکنش التهابی و تخریب بافتی دارد. دومین تغییر غشایی از دست دادن یکنواختی غشاء می باشد که در نکروز در مراحل اول مشاهده می شود در حالی که در آپوپتوز از جمله وقایع ثانویه می باشد(Heemels, Dhand, & Allen, 2000).

1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول

با استفاده از یک پروتئین متصل شونده به فسفاتیدیل سرین این کار صورت می گیرد، که همان

آنکسین V[56] است. در این حالت آنکسین V فقط به فسفاتیدیل سرین موجود در لایه خارجی غشاء متصل می گردد. این روش سریع وساده بوده و سلول ها می توانند فیکس شوند(Hashemi, Karami-Tehrani, & Farzami, 2003).

1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی

بررسی سیتوتوکسیسیتی اولین گام در بررسی آپوپتوز است. با این روش میزان مرگ سلولی مورد ارزیابی قرار می گیرد. این روش قادر به تمایز آپوپتوز از نکروز نیست. با بررسی سیتوتوکسیستیی درصد سلول های زنده یا مرده نسبت به گروه شاهد به دست می آید. دو روش متداول بررسی سیتوتوکسیستی، روش [57]MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو است.

1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی

تغییرات مورفولوژی درآپوپتوز عبارتنداز: چروک شدن سلول، تراکم کروماتین، قطعه شدن هسته و تشکیل اجسام آپپتوتیک(Sun, Jurisicova, & Casper, 1997). در طی این تغییرات، میتوکندری بخوبی حفظ شده در حالی که در هسته تراکم کروماتین وقطعه قطعه شدن DNA رخ می دهد. سلول ها چروکیده شده، از سلول های مجاور جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا می شود که از لحاظ اندازه و ساختمان با یکدیگر متفاوتند.

1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی

در بررسی مورفولوژی هسته ی سلول های آپوپتوزی توسط میکروسکوپ الکترونی، هسته ی قطعه قطعه شده و کروماتین متراکم در کنار آن دیده می شود. سیتوپلاسم متراکم دارای برآمدگی حباب مانند شده و حباب های متفاوتی با اندازه و محتویات متفاوت تشکیل می شوند که برخی از آن ها حاوی قطعه های هسته نیز می باشند. علی رغم تغییرات هسته ای، ارگانل های سیتوپلاسمی در طی مرگ آپوپتوزی به خوبی حفظ شده در حالی که در نکروز هیچ تغییری در کروماتین و هسته مشاهده نشده بلکه سلول متورم شده و غشاء پلاسمایی از هم گسیخته و محتویات سلولی به بیرون می ریزد. این روش وقت گیر و پر هزینه می باشد.

1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس

با میکروسکوپ نوری می توان تراکم کروماتین و اجسام آپپتوتیک در سلول های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین ائوزین(H&E) را مشاهده کرد. میکروسکوپ نوری توانایی کمی برای شناسایی سلول های آپپتوتیک دارد، ولی اگر هسته با پروپیدیوم یدید رنگ آمیزی شود می توان آپوپتوز را از نکروز تمایز داد. میکروسکوپ فلورسانس دقت بیشتری دارد. از رنگ های هسته ای فلورسانس از قبیل هوخست-33258 و [58]DAPI می توان برای تغییرات هسته ای استغاده کرد. این رنگ ها به دلیل خاصیت فلورسانس، در مطالعات میکروسکوپ فلورسنت جهت تشخیص مورفولوژی هسته سلول های آپوپتوزی استفاده می شود. اساس این روش تغییرات اولیه هسته و مشاهده اجسام آپوپتوزی می باشد. باید توجه داشت قبل از رنگ آمیزی، سلول های به هم چسبیده از سلول های مجاورشان جدا شوند(Huerta, Goulet, Huerta-Yepez, & Livingston, 2007).

1-7- منشاءآسیب DNA اسپرم

دلایلایجادآسیبدر DNA اسپرمماننددلایلایجاد ناباروریدرمردانپیچیدهووابستهبهفاکتورهاییازجمله عواملدرونبیضهاییاخارجازبیضهایاست . اگرچهآسیب DNA اسپرمدرمرداننابارورشناساییوبهنقصدرمرحله اسپرماتوژنزمربوطاست،ولیاسپرمافرادبارورنیز بامیزان قابلتشخیصیازآسیب DNA همراهاست(Ozmen, Koutlaki, Youssry, Diedrich, & Al-Hasani, 2007).

اسپرماتوژنزشاملتکثیرسلولهایجنسیمذکر (germ cell)، تقسیممیوزوتمایزاسپرماتیدبهاسپرماتوزوا است.بنابراینآسیب DNA اسپرمیاساختارکروماتینآنمی توانددرهرمرحلهازاسپرماتوژنزرخدهد. آسیب DNA دراسپرماتوزوایبالغمیتواندبهعلتنقایصیدربستهبندی کروماتینباشدکهازشکستگیهایآندوژنیدر DNA ناشی میشودیاناشیازروندآپوپتوزقبلازانزالاسپرمهاباشد . بهعلاوهمیزانبالایتولید ROS نیزمیتواندمنجربهآسیب DNA شود(Aitken & Krausz, 2001; Moustafa, et al., 2004; Zini & Libman, 2006). افزونبراین،فاکتورهایمحیطیمانند سن،مصرفدارووسیگار،فاکتورهایهورمونیوافزایش دمایبیضههاوبیماریهاییمانندواریکوسلنیزازدیگر دلایلایجادآسیبدر DNA اسپرمبهشمارمیروند(Gaur, Talekar, & Pathak, 2007; Ozmen, et al., 2007; Schmid, et al., 2007; Ståhl, et al., 2006).

1-7-1- بستهبندیغیرطبیعیکروماتین

ساختارکروماتیناسپرمبرخلافسلولهایسوماتیککه ساختارهیستونیداردازپروتئینهایبیضهایتشکیلشده است. درپستانداران3نوعازاینپروتئینهاوجوددارد، پروتامین1کهعمدهترینپروتئیناتصالیبه DNA است، پروتامین2کهفقطدربرخیازگونههابیانمیشودو پروتئینهایانتقالیکههنگامجابهجاییهیستونباپروتامین بهعنوانپروتئینهایواسطهعملمیکنند . طیمرحلهاسپرمیوژنز،درحدود85درصداینهیستونهایبیضهای توسطپروتامینهاجایگزینمیشودوعلتباقیماندن 15 درصدهیستونها،احتمالابهدلیلنقشژنهایموجوددراین قسمتهادرلقاح،رشداولیهجنینیوبیانیکسریازژنها ازجملهژنهایاثرگذار (Imprinting) است(V.W. Aoki & D.T. Carrell, 2003; Carrell, Emery, & Hammoud, 2007; Tarozzi, Bizzaro, Flamigni, & Borini, 2007). همراهبا جابجاییهیستونها،پروتامینهایغنیازآرژنینوسیستئین طیعبورازاپیدیدیم،گروههایسولفیدریلآزادسریعاًاکسید شدهوباعثتشکیلپیوندهای S-S دیسولفیدیمیشود. وجوداینپیوندهادلیلپایداریساختارکروماتیناست . همچنینوجودمولکولهای Zn باعثبهوجودآمدنپیوندهای غیرکووالان s....Zn....s میشودکهاینپیوندهانیزدرافزایش پایداریساختارکروماتینمؤثرهستند. پسازلقاحدوباره هیستونهایموجوددرژنومتخمکجایگزینپروتامینها شدهوفرایندمتراکمشدنکروماتینخاتمهمییابد . در حقیقتنقصدرمحتوایمیزانپروتامیندرمرداننابارور بیانگرعدممتراکمشدنصحیحکروماتینبرایروندلقاح طبیعی،مستعدشدنبهآسیب DNA، تراکمزودرس کروماتین (PCC) بعدازانجام ICSI بودهوباعدمفعالشدن تخمکهمراهاست.

مطالعاتمختلفنشاندادهاندکهدرمرداننابارورنسبت هیستون/ پروتامیننسبتبهافرادباروربیشتراست . وجود نقصدرنسبتهیستون / پروتامینباعثنقصدرتراکم کروماتیناسپرمشدهکههمینامرمستعدشدن DNAی اسپرم برایآسیبدرمقابلشوکهایخارجیرابهدنبالدارد. نتایجاخیربیانگریکارتباطمستقیمبینکمبودپروتامینو آسیب DNA ودرنتیجهکاهشمیزانلقاحدراینبیماران است(Zini & Libman, 2006).

1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری

1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم

سلامت کروماتین هسته اسپرم علاوه بر ساختارهای نوکلئوزومی و عملکرد هیستون­ها که در هسته سلول­های سوماتیک اتفاق می­افتد، وابسته به پروتئین هسته­ای دیگری به نام پروتامین است. پروتامین یکی از پروتئین­های مهم در سلول­های جنسی مذکر است و نقش مهمی در باروری مردان ایفا می­کند. پروتامین یکی از پروتئین­های هسته­ای بوده و که به DNA متصل است. این پروتئین در روند اسپرمیوژنز با اتصال به DNA هسته اسپرم از طریق جایگزینی با پروتئین­های هیستونی باعث متراکم شدن مضاعف ژنوم هسته اسپرم می­شود. این پدیده نقش بسیار مهمی در توانایی اسپرم در فرایند لقاح و باروری تخمک ایفا می­کند. تحقیقات زمینه­ای بیانگر این است که هر گونه تغییری در بیان طبیعی یا عملکرد این پروتئین احتمالاً منجر به ناباروری و عقیم شدن مردان می­شود. با توجه به اینکه هر ساختار پروتئینی از بیان یک ژن حاصل می­شود، مقدار صحیح بیان یک پروتئین و عملکرد طبیعی آن وابسته به یک ساختار ژنی سالم و نیز تنظیماتی است که پس از رونویسی، طی ترجمه و پس از ترجمه صورت می­گیرد. از این رو در کنار تمام تحقیقاتی که در رابطه با پروتامین صورت می­گیرد، بررسی نقص­های احتمالی در ساختار ژنی و نیز سطوح رونویسی و ترجمه از ژن، لازم و ضروری است.

1-9- نقشآپوپتوزدرآسیب DNA اسپرم

طیرونداسپرماتوژنزدرپستانداران،مرگسلولهای زایندهرخمیدهدوبهنظرمیرسدکهاینمرگبرنامهریزی شدهباعثحذف25درصدازاسپرمهامیشود . مرگ انتخابیسلولهابهصورتطبیعینقشمهمیرادرروند اسپرماتوژنزایفاءمیکند(Angelopoulou & Karayiannis, 2000; Blanco‐Rodríguez & Martínez‐García, 1996).

مرگسلولهابهطورعمدهتوسطمکانیزمآپوپتوزکهیک پدیدهفیزیولوژیکهمراهبایکسریوقایعآبشاریاست،رخ میدهد.مطالعاتمتعددرویموشنشانمیدهدکه فاکتورهایپرووآنتیآپوپتوزنقشمهمیراطیروند اسپرماتوژنزوایجادهموستازدرسلولهایزایندهایفاء میکند.بهعلاوهسلولهایسرتولیازطریقسیستم [59]FAS میتوانندآپوپتوزرا شروعومیزانآنراتنظیمکنند . اینسیستمفعالیتخودرااز طریقواکنشبینپروتئین FAS بالیگاندخود (FAS) انجام میدهد.همچنینفعالیتهایآبشاریدرروندآپوپتوزشامل فعالشدناندونوکلئازهاکهشکستدررشتههای DNA را القاءمیکندنیزهست . تخریب DNA بهقطعات Kb185 یکیازنشانههایمشخصهآپوپتوزومرگسلولیاستکه ازهمینخاصیتبرایشناساییسلولهایآپوپتوزشده، استفادهمیکنند(Ozmen, et al., 2007).

روندآپوپتوزدونقشعمدهراطیاسپرماتوژنزطبیعی ایفاءمیکندکهعبارتندازکاهشسلولهایزایندهبهآن تعدادیکهتوسطسلولهایسرتولیحمایتشودوهمچنین حذفانتخابیاسپرمهایغیرطبیعی . طیاینروند بسیاریازسلولهایناکارآمدازجملهسلولهایمسن،نابالغیا آسیبدیدهحذفمیشوند. پیامدآپوپتوزرخدادنیکسری ازوقایعازجملهاختلالاتغشایسلول،نامنظمشدن اسکلتسلولی،متراکمشدنهستهوقطعهقطعهشدنساختار DNA است(Huszar, Sbracia, Vigue, Miller, & Shur, 1997; Sakkas, et al., 1999; Tarozzi, et al., 2007). بهعلاوهیکسریپروتئینازهای ویژهبهنامکاسپازنیزنقشمهمیرادرتنظیممیزانآپوپتوز ایفاءمیکنند.اینپروتئینازهاابتدابهصورتپروآنزیمدر اپیتلیوملولههایمنیسازترشحشدهوسپسباعثشروع فعالیتهایآبشاریدیگریمی شوندکهسیگنالهای پروآپوپتوزراالقاءمیکند. گیرندههایمرگسلولیدرسطح اسپرممانند FAS وگیرنده TNFα ازجملهفاکتورهاییهستند کهتوسطآنزیمکاسپازفعالشدهومنجربهمرگسلولی میشود(Ozmen, et al., 2007; Tarozzi, et al., 2007).

احتمالاًمکانیسمهایمختلفیدررابطهبااسپرماتوزوای غیرطبیعیدرمایعمنیوجودداردکهازآنجملهمیتوانبه نظریه Abortive apoptosis یافرارازآپوپتوزاشارهکردبهاین صورتکهوجودمارکرهایآپوپتوزدرمایعمنینشاندهنده تولیداسپرمغیرطبیعیاستکهازفرایندآپوپتوزفرارکردهو منجربهبیاننشانگرهایآپوپتوزشدهاست(Aitken, Baker, & Sawyer, 2003; Sakkas, et al., 2002).

1-10- استرساکسیداتیوبهواسطه ROS

اسپرمبهدلیلوجوداسیدهایچربغیراشباعفراواندر سطحغشایپلاسماییوهمچنینبهدلیلکمبودآنزیمهای محافظتیدرسیتوپلاسمدربرابرشوکهایاکسیداتیوبسیار آسیبپذیراست . طیدههگذشتهمطالعاتنشاندادهاستکه شوکاکسیداتیوباعثایجادآسیبغشایپلاسماییاسپرم شدهواحتمالاًبرفعالیتاسپرمتاثیرمیگذاردومنجربه ناباروریمردانمیشود.منشاءتولید ROS درمایعمنیابتدا خوداسپرماتوزوآوسپسلوکوسیتهایچندهستهایاست(Aitken & Baker, 2004, 2006; Aitken & De Iuliis, 2007; Hammadeh, et al., 2006; Lopes, Jurisicova, Sun, & Casper, 1998).

بهعلاوهمطالعاتنشانمیدهدکهارتباطمعنیداریبین تولید ROS وآپوپتوزوجودداردکهدرنهایتمنجربهآسیب DNA دراسپرممیشود(Irvine, et al., 2000; Lopes, et al., 1998).

همچنینمشخصشده،درافرادیکهمیزانزواید سیتوپلاسمیدرمایعمنیزیاداست،مرحلهاسپرماتوژنز غیرطبیعیبودهوباافزایشمیزانتولید ROS همراه هستند(Aitken, et al., 1998; Huszar, et al., 1997).

1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری

عوامل محیطی که شامل عوامل اجتماعی و شیمیایی است. به طور خلاصه میتوان عوامل اجتماعی را به زیرگروه هایی چون رفتارهای اجتماعی( استعمال الکل، کافئین، سیگار و سایر مواد مخدر) عوامل شیمیایی( مواجهات شغلی، مواجهه با سرب یا سایر فلزات سنگین، مواجهه مستمر با گرما، دارو، شیمی درمانی و رادیو تراپی، آلودگی های اتمسفر) سن، ژنتیک و سن ازدواج افراد تقسم بندی کرد(Paul, Melton, & Saunders, 2008).

1-11-1- مصرف سیگار

بین مصرف سیگار و کاهش کیفیت مایع منی ارتباط وجود دارد مواد مضری چون آلکالوئید، نیتروزآمین، نیکوتین و هیدروکسی کوتینین در سیگار وجود دارد که باعث تولید رادیکال های آزاد در بدن می شود(Künzle, et al., 2003). در ضمن با استفاده از تست های [60]SCSAو TUNEL [61] مشخص شده است که آسیب DNA اسپرم در افراد سیگاری بسیار بیشتر از افراد غیر سیگاری است. برای افزایش فراگمنتاسیون DNA دو علت ذکر شده است:

1) انتشار لکوسیت ها متعاقب استرس اکسیداتیو ناشی از متابولیت های دود سیگار که سبب واکنش التهابی از طریق آزادسازی واسطه های شیمیایی مانند اینترلوکین6 و 8 در مجاری ژنیتال شده و خود باعث فعال شدن مجدد لکوسیت ها و افزایش رادیکال های فعال اکسیژن ROS می شود.

2) میزان کمترآنتی اکسیدا نت ها در مایع منی افراد سیگاری نسبت به غیر سیگاری ها(Potts, Newbury, Smith, Notarianni, & Jefferies, 1999).

همچنین تحقیقات نشان داده است که مواد سرطان زای موجود در دود سیگار بر روند لانه گزینی متعاقب پروسه ی IVF و ICSIو همچنین موفقیت این دو روش در زوج های سیگاری ، تاثیر گذار است(Künzle, et al., 2003) به علاوه پسرانی که مادرشان در دوره ی بارداری سیگار کشیده اند در زمان بلوغ با کاهش پارامترهای اسپرمی مواجه اند(Storgaard, et al., 2003).در معرض دود سیگار قرار گرفتن حیوانات و انسان ها و همچنین در معرض قرارگیری با متابولیت های نیکوتین در محیط بدن، سبب کاهش در صد اسپرم های متحرک زنده و کاهش توانایی نفوذ اسپرم به درون تخمک می شود(Kapawa, et al., 2004). غلظت کوتینین نیز در مایع منی با مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم مرتبط است. گفتنی استمصرف توام سیگار و الکل و تاثیر آن بر پارامترهای اسپرم به میزان چشمگیری بالاتر بوده بنابراین هر یک از والدین حین درمان توسط روش های کمک باروری باید در زمینه عدم استعمال سیگار مشاوره شوند(Martini, et al., 2004).

1-11-2- مواجهات شغلی

تحقیقات نشان داده که مواجهات شغلی می تواند به طور مستقیم یا غیر مستقیم روی نتایج IVF تاثیر گذارد. آلودگی های محیطی از جمله آلودگی هوا و آلودگی هایی که توسط کارخانجات تولید شده است، منجر به تولید مواد و محصولات اکسیداتیو فعال می شود که از آن جمله می توان به افزایش فلزات سنگین مانند سرب، آرسنیک و جیوه یا آلاینده های کشاورزی مانند سموم اشاره کرد. بنابراین ، این آلودگی ها می توانند بر نتایج IVF تاثیر گذارند(Gate, Paul, Ba, Tew, & Tapiero, 1999).

از عوامل دیگر می توان به استرس های دمایی اشاره کرد. دمای بیضه به طور معمول کمتر از دمای بدن است، شرایط شغلی مانند نانوایی، رانندگی و مانند این می تواند باعث استرس گرمایی شود. بنابراین ، این امر منجر به از دست رفتن سلول های جنسی و کاهش اسپرم و نیز کاهش سلامت DNA و نقص بسته بندی کروماتین و سقط زودرس جنین شود(Banks, King, Irvine, & Saunders, 2005; Zhu & Setchell, 2004).

1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی

شیمی درمانی و رادیوترپی باعث افزایش آسیب DNA اسپرم می شود. در این بیماران علاوه بر افزایش میزان آسیب DNA به علت شیمی درمانی، آندوکرینی بیضه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به آزواسپرمی می شود. در این بیماران انجماد اسپرم پیشنهاد می گردد(Howell & Shalet, 2005).

1-11-4- سن

از دیگر عواملی که می تواند بر قطعه قطعه شدنDNA اثر گذارد ، سن است. تحقیقات نشان داده است که در افراد مسن میزان قطعه قطعه شدن DNA و سقط های خود به خودی افزایش می یابد(Kleinhaus, et al., 2006).

1-12- تکنیک­های بررسی ساختار کروماتین

میزان موفقیت تکنیک باروری به سلامت کامل تخمک و اسپرم وابسته است. در دهه 1980 و 1990 میلادی تحقیقات زیادی در زمینه لقاح و تحریک تخمک­گذاری به انجام رسید، ولی در مردان فقط به وجود اسپرم اشاره شد و تحقیقات زیادی در مورد سلامت و عملکرد آن صورت نگرفت.

با پیشرفت تکنیک ICSI[62] نقش اسپرم در تکامل و تکوین جنین مشخص شد. تحقیقات زیاد در این راستا منجر به بررسی تست­های عملکردی اسپرم و ارتباط آنها با باروری شده است. وضعیت کروماتین اسپرم از جمله مباحثی است که بیشتر به آن پرداخته شده، زیرا اسپرم نه تنها در فعال­سازی تخمک مؤثر است، بلکه نیمی از ژنوم نسل آینده توسط اسپرم منتقل می­شود و سلامت آن، جهت تکوین جنینی اهمیت بالایی دارد. در این میان بررسی سلامت DNA اسپرم از اهمیت خاصی برخوردار است که از دلیل اهمیت آن می­توان به موارد زیر اشاره کرد:

1)وجود رابطه معکوس بین پارامترهای اسپرم و آسیب DNA

2) افزایش آسیب DNA در افراد نابارور

3)‌ وجود رابطه معکوس بین میزان لقاح و آسیب DNA

4) افزایش سقط در بیماران با آسیب DNA بالا.

لذا، با توجه به اهمیت سلامت DNA اسپرم در باروری در این قسمت به روش­های بررسی ساختار کروماتین پرداخته می­

[1]Assisted Reproductive Techniques

[2]Intrauterine insemination

[3]In vitro fertilization

[4]Intra Cytoplasmic Sperm Injection

[5]Infertility

[6]Primordial germ cells

[7]Spermatogony

[8]Sexual cord

[9]Sertoli

[10]Spermatogenesis

[11]Semen

[12]Litter Glands

[13]Semen Analysis

[14]World Heaith Organization-

[15]Masturbation

[16]Spermogram

[17]Morphology

[18]Head

[19]Midpiece

[20]Tail

[21]Adenosine three phosphate

[22]Zona pllucida

[23]Motility

[24]Preaxonem

[25]Reactive Oxygen Species

[26]Astenozoospermia

[27]Varicocele

[28]Computer-aided sperm analysis

[29]Quick progressive

[30]Slow progressive

[31]Non progressive

[32]Viability

[33]Volume

[34]Hypospermia

[35]Hyperspermia

[36]Aspermia

[37]Concentration

[38]Normozoospermia

[39]Oligozoospermia

[40]Polyzoospermia

[41]Azoospermia

[42]Necrosis

[43]Programmed Cell death

[44]Cellular Apoptosis

[45]Tumor necrosis factor

[46]Lanfotoxin

[47]Apoptotic Body

[48]Phosphatidil serine

[49]Denaturation

[50]Death resptores

[51]Cystein aspartate specific proteases(caspases)

[52]Interleukin Converting Enzyme

[53]Apoptos Inducing Factor

[54]Propodiomiodid

[55]Di Amino-2-Phenyllodole-

[56]Anexine V

[57]Methyle Tetra Tyazoli phenyl

[58]Diamidino-2-phenylindole

[59]apoptosis stimulating fragment

[60]Sperm chromatin structure assay

[61]Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling

[62]Intra Cytoplasmic Sperm Injection-




یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:18
0 نظر