دانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایلدانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایلتولید نوروسفر از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان
 تولید نوروسفر از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوانچکیده هدف :هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که آیا MSCs بعد از کشت طولانی مدت میتوانند به طورخودبخودی به سلولهای پیشساز عصبی تمایز یابند.مواد وروشها: این تحقیق شامل دو گروه میباشد: کشت پاساژ پنجم MSCs در محیط کشت -MEMαو FBS%10 به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجمMSCsبدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژنهای نورونی (Nestin،TH وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی NestinوβІІІ-tubulinبه منظور تعیین سلولهایی که این نشانگرها را بیان میکنند استفاده شد.نتایج: پاساژ پنجم MSCsکه از موش صحرایی بالغ استخراج شدند،بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلولهای شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت میدهند. بعد از هفته دوم کشت، سلولهای شبه نورونی به نشانگر βІІІ-tubulinواکنش مثبت نشان دادند.بررسیهای آماری نشان داده است که MSCsدر گروه آزمایشی افزایش معنیداری از ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک NGFو GDNFو ژنهای نورونی NestinوNurr1را نسبت به گروه کنترل نشان دادند .(p<0.05)نتیجه گیری: در این مطالعه نشان داده شد که MSCsدر کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا میکنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القاکننده خاص همراه شوند و قادرند ژنهای اختصاصی نورونهای دوپامینرژیک مانند THوNurr1را بیان کنند.مطالعات ما نشان میدهد که MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلولهای نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد میشود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماریهای نورولوژیکی باشند. کلید واژگان: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر فهرست مطالب مقدمهو مروری بر مطالعات گذشته.. 1 1-3 سلولهای بنیادی مغز استخوان.. 5 1-3-1مارکرهای سطحی خاص سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 8 1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 8 1-3-3پتانسیل تمایزی سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 10 1-4 کاربرد درمانیسلولهای بنیادی مزانشیمی.. 14 1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی(NTFs) و ساختمان مولکولی گیرندههای مربوط به آنها 17 1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک.. 17 1-5-1-1انواع فاکتورهای نوروتروفیک.. 18 1-5-2 گیرندههای مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20 1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTRو اتصال نوروتروفین.. 20 1-5-2-2 ساختار گیرنده Trkو اتصال نوروتروفین.. 22 1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31 2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36 2-2 جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ 36 2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM.. 36 2-2-2 طرز تهیهPBS فاقد کلسیم و منیزیم (2/7 : PH).. 37 2-2-3 طرزتهیه تریپسین/ EDTA. 37 2-2-4 روش جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مغز استخوان.. 39 2-3 تأیید هویت سلولهای استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39 2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%.. 41 2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد.. 41 2-3-1-4طرز تهیهPBS ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH).. 42 2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42 2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز.. 43 2-4بررسی مارکر عصبی βIII-tubulinدر سلولهای مزانشیمی مغز استخوان به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفرها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45 2-6 بررسی مولکولی بیان ژنهای اعضای خانواده نوروتروفین.. 46 2-6-1 استخراج RNAکل از سلولهای کشت شده.. 46 2-6-2بررسی کمی و کیفی RNAاستخراج شده.. 48 2-6-3 الکتروفورز ژل آگارز.. 49 2-6-4 واکنش ساخت cDNA(واکنش رونویسی معکوسRT-).. 52 2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها.. 54 3-1مشاهده مورفولوژی سلولهای مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59 3-2 تعیین هویت سلولهای مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71و آلکالین فسفاتاز 60 3-3 ویژگیهای مورفولوژیکی سلولهای مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت 60 3-4 تأیید هویت سلولهای عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60 3-5 تأیید هویت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستین.. 61 4-1 مورفولوژی سلولهای بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آنها 71 4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 72 4-3 پتانسیل تمایز سلولهای بنیادی مغز استخوان به سلولهای عصبی 74 4-4 تولید نوروسفر از سلولهای بنیادی مغز استخواندر کشت طولانی مدت 76 فهرست شکلها شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTRتنظیم میشود.. 22 شکل 1-2.نوروتروفینها و گیرندههای مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و P75NTR. 23 شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trkتنظیم میشود... 24 شکل 1-4. سلولهای بنیادی عصبی و ردههای سلولی مربوط به آن.... 25 شکل 1-5 .ارزیابی شکلگیری نوروسفر.. 26 شکل 2.شناسایی سلولهای استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. 63 شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCsدر پاساژ پنجم بعد از دو هفته .. 64 شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCsپس از هفته سوم.. 65 شکل4تأیید هویت سلولهای عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی 66 شکل 5 تأیید هویت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستین .. 66 نمودار 6 A. مقایسه میزان بیان نسبی ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.... 68 نمودار6 B.مقایسه میزان بیان نسبی ژنهای نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69 فهرست جدولها جدول1-1 . اسامی گوناگون سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 6 جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرایمرها، F: پرایمر بالادست ، R: پرایمر پایین‌دست 57 فصل اول مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته مقدمه امروزه تحقیق بر روی سلولهای بنیادی به دانش پیشرفتهای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد میشود ]1[. سالهاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا میتوان درمان را بر پایه این سلولها بنا نهاد. این تفکر وتحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده میشود که از آن به عنوانreparative (regenerative) medicineنام برده میشود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلولهای بنیادی از اهمیت ویژهای برخوردار است. خصوصا"علیرغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلولهای بنیادی وجود دارد ]3[. سلولهای بنیادی، سلولهای زایای[1]غیر بالغاند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ میکنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعهای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلولهای بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسمهای تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] میباشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول بنیادی دو سلول دختری ایجاد میگردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلولهای بالغ تمایز پیدا میکنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلولدختری ایجاد میگردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی میمانند] 5،6[. بنابراین سلولهای بنیادی، سلولهای تمایز نیافتهای میباشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایزیافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[. سلولهای بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم میشوند: همه توان[5]: جزء اولین سلولهایی هستند که در جنین شکل میگیرند(از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)، قابلیت تمایز به انواع سلولهای ارگانیسم را دارند] 4[. پرتوان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء میگیرند. اینسلولها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[. چند توان[8]: این گروه را سلولهای بنیادی بالغ[9] و یا سلولهای بنیادی سوماتیک نیز مینامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ میشوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمانهای مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلولهای بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلولهای خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌هایBوT و ... تمایز مییابند [9،10[. سلولهای بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دستهی، سلولهای بنیادی جنینی (ESCs)[10]وسلولهای بنیادی بالغتقسیم میشوند. از آنجا که استفاده از سلولهای بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلولها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلولهاست به گونهایکه قابلیت تمایز بالاییداشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[. سلولهای بنیادی مزانشیمی از مهمترین سلولهای بنیادی بالغ است. این سلولها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966استخراج شدند ]12[. سلولهایبنیادیمزانشیمیتوانتمایزبه چندیندودمانسلولیازجملهاستخوان،عصب،غضروفوکبدرا دارند] 13 .[این سلولهابهعنوانیکمنبعایدهآلبرای سلولدرمانی،ژندرمانیوبهعنوانابزاریبرایدرمانبیماریهای مادرزادی محسوب میگردند] 14[. گزارشهایی مبنی بر استفاده از اینسلولهادرمدلهایحیوانیبرایدرمانجراحاتنخاعی]15،16[،سکتةمغزی]17 [وپارکینسون] 18 [وجوددارد. 1-1 سلولهای بنیادی جنینی: اولین تحقیقات در زمینه ESCsدر دهه 1960 شروع شد،هنگامیکهFinch و Ephrussii درسال1960 ، سلولهای سرطانی جنینی چند توان را از سلولهای زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند]19.[ این سلولها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس درسال 1998، سلولهای بنیادی جنینی انساناستخراج شدند]20،10.[سلولهای بنیادیجنینیفعالیتتلومرازیشدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای که سلولهای بنیادی جنینی انسانی را میتوان در شرایط محیط کشت تا بیش از یکسال به صورت تمایز نیافته حفظ کرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند]10.[ حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگیهای اختصاصی سلولهای بنیادی جنینی میباشد] 21.[ این سلولها از توده سلولی داخلی بلاستوسیستجداسازی میشوند که دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent مینامند. محققین اولین باراین سلولها را از mice و اخیرا" از انسان و پریماتها جداسازی کردهاند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلولهای بنیادی جنینی موش این است که این سلولها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار میگیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوریپوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافتهای تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگیها در سلولهای بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[.بنابراین گرچه سلولهای بنیادی جنینی از قدرت تکثیر و تمایز بالایی برخوردارند اما کاربرد این سلولها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ایمنی را در فرد گیرنده افزایش میدهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلولهای بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات متولد شده پیوند زده میشودند تولید تومور میکنند که حاوی انواع متفاوتی از بافتها شامل: پوست، مو و عضله میباشد که تراتوما نامیده میشود]25[، حضور سلولهایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلولهاست بنابراین استفاده درمانی از این سلولها با مشکلاتی همراه است]7[. 1-1 سلولهای بنیادی بالغ سلولهای بنیادی بالغ،سلولهای سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلولهای بنیادی بالغ،سلولهای سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلولهای بافتی که از آن منشا میگیرند، تمایز یابند. این سلولها را میتوان در بافتهایی مثل استخوان تیغه‌ای (ترابکولار)، بافت چربی، مغز، سینوویوم، عضله اسکلتی، ریه، طحال، کبد، کلیه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندانهای شیری و سلولهای اطراف عروق مربوط به ژله وارتون بند ناف انسان نیز مشاهده نمود [14،26]. یکی از نکات مهم در مورد سلولهای بنیادی بالغ این است که تعداد آنها در هر بافتی محدود است. این سلولها در حالت عادی در ناحیه خاصی از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسیم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرایط فیزیولوژیک یا بدنبال ایجاد ضایعه، به سلولهای بافتی که در آن قرار دارند تمایز یابند و بافت آسیب دیده را ترمیم کنند و یا تحت شرایط خاصی نیز به به سلولهای دیگری که مربوط به آن بافت خاص نمی‌باشد تمایز مییابند، به این ویژگی Trans-differentiationویاAdult stem cell plasticityمی‌گویند [3،27،28]. Ferrariو همکارانش در سال1998اولین بار differentiatioTrans- سلولهایBMSCs را به سلولهای عضلانی و در همان سال Shiو همکارانش تولید سلولهای اندوتلیال از BMSCsراگزارش دادند]29،30[.Petersen تولید سلولهای کبدی از مغز استخوان را بعد از آسیب کبدی و Brazeltonو همکارانش در سال 2000 تولید نورون از BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلولهای استخراج شده از بافتهای دیگر مانند عضله اسکلتی ]33 [و مغز ]34 [نیز این قابلیت تمایزی مشاهده شده است. امروزه فناوری سلولهای بنیادی و قابلیت تمایز آنها به انواع سلولهای بالغ و همچنین استفاده از آنها در درمان بیماریها به طور روز افزونی در حال پیشرفت بوده که امیدواریهایی را در جهت ایجاد روشهای مبتنی بر سلول درمانی به عنوان یک جایگزین مناسب برای پیوند اندام کامل ایجاد نموده است. 1-3 سلولهای بنیادی مغز استخوان سلولهای بنیادی مغز استخوان که در گروه سلولهای بنیادی بالغ قرار دارندشامل دو نوع سلول بنیادی میباشند: سلولهای بنیادی خون ساز [11](HSCs)و سلولهای بنیادی مزانشیمی MSCs[12] یاBMSCs) )]10،26 .[سلولهای بنیادی مزانشیمی از مهمترین سلولهای بنیادی بالغ هستند که به دلیل دارا بودن خاصیت خود تکثیری و توان تمایزی بالا، منبع مناسبی برای استفاده در برخی روشهای سلول درمانی و ژن درمانی میباشند. این سلولها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال1966شناسایی شدند. اینمحققین سلولهای پیشساز تشکیل دهنده استخوان[13] را جداسازی کردند]12[. MSCsدارای ویژگیهایی هستند که آنها را ازHSCs میتوان تشخیص داد، این سلولها قابلیت اتصال به ظروف کشت را دارند، از سلولهای خونساز مغز استخوان جدا میشوند، به صورت سلولهای فیبروبلاست شکل، تکثیر یافته و تشکیل مجموعههای کوچک سلولی متشکل از حدودا" 50سلول را میدهند که به عنوان واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی ( [14](CFU-Fsتعریفمیشود]35[.طی تحقیقاتیکه توسط OwenوFridensteine در سال 1998و Digirolamoدر سال 1999 انجام شد، نشان داده شد که کلونیهای CFU-Fاز نظر شکل ظاهری، اندازه و توانایی تمایز بسیار ناهمگن هستند. مجموعهی سلولی چسبنده خیلی سریع رشد کرده، وقتی به تراکم مناسب رسید، برای تکثیر بیشتر دوباره کشت داده میشود ]36،37[. این سلولهاقادرند قدرت تکثیری خود را بیش از 40 برابر، حفظ میکنند]4،38 [. در مطالعات مختلف، سلولهای بنیادی مزانشیمی را با نامهای متفاوت به کار بردهاند که در جدول )1-1) آمده است ]14.[ جدول1-1 . اسامی گوناگون سلولهای بنیادی مزانشیمی
علاوه بر موارد بالا، جمعیت سلولی به همراه سلولهای بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جدا میشوند این سلولها را اصطلاحاًسلولهای زاینده چند ظرفیتی بالغ [15](MAPC)مینامند و در محیط کشت به رده سلولهای نورواکتودرمی و اندودرمی تمایز مییابند [41،40،4]. اخیراً حضور MSCsدر بافتهای دیگری به غیر از مغز استخوان اثبات شده است که شامل: پری استئوم،استخوان ترابکولار، بافت چربی، سینوویوم، عضله اسکلتی، پالپ دندان، بافت زیرجلدی پوست پس سر، لیگامان دور دندان، خون مایع آمنیوتیک، تیموس، طحال موش و انسان بالغ میباشد ]4، 26 .[ تاکنون دو نوع سلول بنیادی از بافت چربی استخراج شده است که با نامهای مختلفی به کار برده میشوند که شامل ] [16]PLA10،42 [و سلولهای بنیادی بالغی که از بافت چربی جداسازی میشوند[17](ADAS)]10،43[. این سلولها از توانایی تمایزی یکسانی برخوردارند. بنابراین پیشنهاد شدهاست که یک سیستم مزانشیمیدر همه بافتهای بالغحضور دارد. بطورتجربی MSCsکه از بافت چربی و بند ناف استخراج میشوند مشابه BMSCs، برای استفاده در درمان مورد توجه قرار گرفتهاند، البته در مواردی با BMSCsتفاوت دارند که میتوان به این صورت ذکر کرد: قدرت تکثیر در سلولهای مزانشیمی که از بافت چربی منشا میگیرند بالا بوده ولی قدرت تکثیردر سلولهای مزانشیمیکه از بند ناف منشا میگیرند بسیار پایینتر است. در سلولهای مزانشیمیکه از بافت چربی استخراج شده مارکر سطحی CD106 و در سلولهای مزانشیمی بند ناف مارکر سطحیCD90وCD105 بیان میشود و قدرت تمایز و بیان ژن در سلولهای مزانشیمی بند ناف کمتر است ]4،44، 45 .[ MSCs، 1/0-001/0 درصد از جمعیت سلولهای هسته دار مغز استخوان را تشکیل میدهند ]10،11 .[این سلولها از توانایی ازدیاد و تکثیر بالایی در شرایط آزمایشگاهیبرخوردار هستند و به ردههای سلولی متعددی تمایز مییابند]4.[MSCsهمچنین ژنهایی با منشاٴ جنینی، مولکولهای شرکت کننده در اتصالات بین سلولی، پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی مثل کلاژن تیپ 1و فیبرونکتین را بیان میکنند. علاوه برآن، سایتوکینهایی مانند اینتر لوکین 8، 11، فاکتورهای[18]SCFوSDF-1[19] را ترشح و بیان میکنند ]4،11،46[. در واقع سلولهای بنیادی مزانشیمی موجود در مغز استخوان یک نیچ یا کنامتنظیمی برای سلولهای بنیادی خون ساز ایجاد میکنند]14،47[.در این محیط سیتوکین‌های آزادشده و میان کنشهای بین سلولی، نقش مهمی را در تکثیر و تمایز پیش سازهای خونی ایفا میکنند [48].
1-3-1مارکرهای سطحی خاص سلولهای بنیادی مزانشیمی تلاشهای چشمگیری برای شناسایی مارکر سلولی خاص برای سلولهای MSCsانجام شده است اما نشانگر اختصاصی این سلولها هنوز شناخته نشده است. MSCsممکن است توسط عدم بیان مارکرهای هماتوپویتیک مانند CD14، CD45، CD34و عدم بیان مارکر اندوتلیالی (CD31/PECAM-1)وبیان ترکیبی از مولکولهای سطحی مانند SH2) CD105یا(endoglin CD73 (SH3-SH4)، CD106 (VCAM-1)، CD44 (گیرنده اسید هیالورونیک)، CD90 (Thy1.1)، CD29، STRO-1،CD54 (ICAM-1)،CD94 ،CD13 ،CD47 ،CD164 ] 51[ ] CD7149،50[،مارکرهای فیبرونکتین] 51[و آلکالین فسفاتاز ]48[ شناسایی میشوند. بسیاری از مارکرهای مولکولی دیگر مانند: مولکولهای چسبنده، کموکاینها، گیرندههای سایتوکین مانند گیرنده فاکتور رشد اپیدرمیEGFR[20])یا ] (HER-14،52[و مولکولهای درگیر در پاسخ ایمنی (MHC class I and II, CD119/interferon-g-receptor)توسطMSCs بیان میشوند]4،53.[ 1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلولهای بنیادی مزانشیمی سلولهای بنیادی مزانشیمیدارای ویژگی تنظیم کنندگی سیستم ایمنی می باشند. یکی از خصوصیات مورد توجه MSCs گریز این سلولها از شناسایی و مهار پاسخ ایمنی استکه این امر به دلیل خواص فنوتیپی و عملکردی آنها میباشد]54[.خصوصیت مهاری MSCs، انواعی از عوامل سیستم ایمنی شامل TcellهایCD+4،CD+8 ]4،55،56[،]Bcell 53،57[، سلولهای کشنده طبیعی (NK cell)1 ]4،58 [و سلولهای دندریتیک تمایز یافته مونوسیتها] 4،59[را سرکوب میکنند. MSCs ممکناست واکنشایمنی را در شرایط in vitro و in vivo با یک روش مستقلاز MHC[21]مهارکنند] 4،53،60[. اگر چه در حال حاضر مکانیسمهای دقیق سرکوب سیستم ایمنی به واسطه MSCsکاملا مشخص نیست اما در مجموع، عوامل متعددی که در تنظیم سیستم ایمنیو مهار ازدیاد سلولهای Tتوسط MSCsاستفاده میشود شامل ترشح فاکتورهای رشد ( اثر غیرمستقیم) و ارتباط سلول با سلول (اثر مستقیم) میباشد] 4،53،60[. تنظیم سیستم ایمنی نهتنها توسطMSCs ، بلکه توسط سلولهای تمایز یافته مثل فیبروبلاست، ادیپوسیت و استئوبلاست نیز گزارش شده است ]4[. در مدل موش این سلولها میتوانند پاسخ ایمنی اختصاصی به آنتیژن که با واسطه سلولهای Tخاطره و عادی ایجاد میشود را مهار کنند که این مسیر به طورقطعی هم راستا با اتصال سلول با سلول است ]4،61[ بر خلاف مدل موش، در انسان اثرات مهاری سیستم ایمنی توسط MSCs، در غیاب ارتباط سلول به سلول و با واسطه ترشح فاکتورهای محلول میباشد] 4 ،53،60[. در بین فاکتورهای محلول، فاکتور[22]β1–TGFو فاکتوررشد هپاتوسیتی[23] ]4،62[، پروستاگلاندینE2،فاکتور رشد اندوتلیوم وسکولار[24] ]59،63[، ایندول آمین 2و3 دی اکسیژناز (IDO)] 53،56[،از عوامل شرکت کننده در فعالیت سرکوب ایمنی توسط MSCsانسانی میباشند .در این سلولها آنتی ژنهای MHCکلاس 1 به مقدار کم بیان میشوند ولی آنتیژنهایMHC کلاس 2 بیان نمیشوند. عدم بیان مولکولهای MHCکلاس2 این امکان را به وجود میآورد که MSCsاز شناسایی سلولهای T فرار کنند]54[. نحوه بیان آنتی ژنهایMHC کلاس1 توسط سلولهای مزانشیمی بسیار مهم است زیرا بیان این مولکول ها در سلولهای بنیادی مزانشیمی باعث محافظت آنها در مقابل سلولهای کشنده طبیعی خواهد شد. عملکرد اصلی سلولهای کشنده طبیعی از بین بردن سلولهای توموری است که مولکولهایMHC بر سطح آنها کاهش یافته است] 64[.MSCs علاوه بر عدم بیان مولکولهای MHCکلاس 2، مولکول های کمک تحریکی از جمله CD80 (B7.1)CD86 (B7.2)و CD40Lرا نیز بیان نمیکنند این مولکولها برای القا پاسخ سلولهای T عملکردی لازم هستند]54[. MSCsتحت تاثیر عوامل ریز محیطی قرار میگیرند و به بعضی از سایتوکینهای التهابی از جمله IL-1β]65[،]IL17 66 [و از همه مهمتر ایتنرفرون گاما (IFN-γ) پاسخ داده و عملکرد آنها به طور چشمگیری تحت تاثیر قرار میگیرد.IFN-γ در بعضی از شرایط فعالیت سرکوب ایمنی سلول بنیادی مزانشیمی را افزایش میدهد] 53[. سلولهایNK ، از عوامل اصلی ایمنی ذاتی هستند که در حذف سلولهای بدخیم و آلوده به ویروس نقش کلیدی دارند ]67[. سلولهایT،B و پیش سازهای سلولهای کشنده طبیعی از مغز استخوان منشا میگیرند که در آنجا با سلولهای بنیادی مزانشیمی بر هم کنش نزدیکی دارند. نتایج چندین مطالعه بیانگر این مطلب است که تکثیر سلولهای کشنده طبیعی در حضور IL2وIL15، توسطMSCs مهار میگردد ]68.[همچنینMSCs سبب القا ترشح سایتوکینهایی همچون IFN-γوTNF-α بوسیله سلولهایNK میشوند.اثرMSCs بر تولید سایتوکینها توسط سلولهایNKطی مطالعاتی بررسی شد. Sotiropoulou و همکارانش در سال2006 گزارش دادند که سلولهای کشنده طبیعی فعال شده باIL2 ، بعد از کشت با سلولهای بنیادی مزانشیمی، مقادیر خیلی کمی از سایتوکینهای القا کننده IL15(IFN-γو به مقادیر کمترIL10و (TNF-α را تولید میکنند]68[، Spaggiariو همکاران نشان دادند که سلولهای کشنده طبیعی فعال شده با IL2، بعد از مجاورت کوتاه مدتباسلولهای بنیادی مزانشیمی IFN-γرا تولید مینمایند] 58[. در مطالعهای Poggiو همکارانش نشان داده شد که سلولهای کشنده طبیعی تازه جدا شده، بعد از مجاورت با سلول بنیادی مزانشیمی، TNF-αو IFN-γراترشح میکنند،واکنش متقابل بین گیرنده ICAM-1 روی MSCsوگیرنده LFA-1روی سلولهای NKبرای تولید سایتوکینها ضروری است ]58، 69[. طیمطالعاتی به خوبی مشخص شده استکهIFN-γ نقش مهمیدر پیشبرد فعالیت سرکوبگری MSCsدارد] 70[.همسو با این مشاهدات، Kramperaو همکارانش نشان دادندکه با اضافه کردن آنتی بادی علیه گیرنده IFN-γ در محیط کشت، از مهار پاسخ ایمنی توسط MSCsبر روی سلولهایTCD4+،TCD8+و حتی سلولهای کشنده طبیعی ممانعت به عمل میآید] 53[. از آنجائیکه MSCsعملکرد سلولهای T خاطرهای، سلولهای Bو سلولهای کشنده طبیعی و همچنین تمایز و عملکرد سلولهای دندریتیک مشتق شده از مونوسیتها را سرکوب میکنند، پس میتوان گفت که سلولهای بنیادی مزانشیمی تقریباً تمام سلولهای شرکت کننده در پاسخ ایمنی را مهار میکنند و به دلیل گریز این سلولها از شناسایی و پاسخ ایمنی ضعیف، در روند درمان و پیوند حائز اهمیت می باشند] 71 .[ 1-3-3 پتانسیل تمایزی سلولهای بنیادی مزانشیمی سلولهای بنیادی مزانشیمی، سلولهای چند توان multipotent)) هستند که توانایی تمایز بهرده سلولهای مزانشیمی مانند استئوسیت، کندروسیت و ادیپوسیت [12، 13] را دارا هستند. علاوه بر این سلولهای مزانشیمی تحت شرایط آزمایشگاهی قادرند به رده سلولهای غیر مزانشیمیاز جمله عضله اسکلتی [29]، عضله قلبی [72]، هپاتوسیت‌ها [31] حتی نورون و گلیا نیز تمایز یابند، این ویژگی سلولهای مزانشیمی را Transdifferentiation مینامند.MSCsدر محیط کشت حاوی β-گلیسرول فسفات ، اسید آسکوربیک 2- فسفات، دگزامتازون و سرم جنین گاو به استئوبلاست تمایز پیدا میکنند، همچنین در شرایط کشت سه بعدی، محیط فاقد سرم و وجود یکی از اعضای خانواده TGF-β، به سلول های کندروژنیک تمایز مییابند. در این شرایط سلولها به سرعت مورفولوژی فیبروبلاستی خود را از دست میدهند و شروع به بیان ماتریکس خارج سلولی خاص سلولهای غضروف مینمایند، که این حالت با بیوسنتز سریع گلیکوزآمینوگلیکانوتغییردر مورفولوژی سلولها همراه میباشد]12[.MSCs برای تمایز به رده سلولهای چربی همراه با تولید واکوئلهای غنی از چربی، نیازمند حضور ایزوبوتیل متیل گزانتین میباشد[12]. Taylorو Jonesتمایز میوژنیک سلولهای جنینی و بالغ [73] و Wakitaniو همکارانش، تمایز میوژنیک سلولهای استرومایی موش صحرایی در حضور 5- آزا سیتیدین را گزارش دادند[74]. علاوه براین Phinneyو همکارانش گزارش دادند که MSCsموشی که در معرض آمفوتریپسین Bقرار گرفته باشند فیبرهای چند هستهای میوتوب مانند، ایجاد میکنند [75]. MSCsاستخراج شده ازموش صحرایی و انسانبا روشهای مختلف کشت به سلولهای شبه نورونیتمایز مییابند. بنابراین استفاده از این سلولها امید بزرگی در درمان بیماریهای نورو- دژنراتیو میباشد ]76، 77[. در شرایط فیزیولوژیک،MSCs قابلیت تمایزی و خود تکثیری بالایی دارند. مطالعات نشان داده، که سلولهای بنیادی عصبی[25]((NSCs نیز بدلیل دارا بودن چنین ویژگیهایی همواره مورد توجه محققان بودهاند]78،79[،این سلولها نه تنها قادرند به سلولهایی با منشا اکتودرمی تمایز یابند بلکه قادرند به سلولهای خونی نیز تمایز یابند] 32[. همین ویژگی در سلولهای بنیادی مزانشیمی نیز دیده شده است بطوریکه آنها به سلولهایی با منشا غیر مزودرمی مانند سلولهای عصبی نیز تمایزمییابند. Tershikhو همکارانش در سال 2001 نشان دادند که یکسری فاکتورهای نسخه برداری توسط هر دو سلولهایMSCs و NSCsبیان میشود، از جمله ژن اریتروپویتین- فاکتور رشد خونساز و رسپتورش، در مغز انسان، میمون و موش بیانمیشوند] 80[.ارتباط بین بیان ژنهای مختلف در این دو گروه، بدلیل ظرفیت تمایزی بالا و یکی از فاکتورهای مسئول پلاستیسیتی این سلولها میباشدکه در هر دو مطالعات invitroوin vivo مشاهده شده است ]78[. تاکنون روشهای متعددی مبنی بر تمایز MSCs به نورون گزارش شده است که شامل: - القاگر شیمیایی - سایتوکینها - هم کشتی[26] با سلولهای عصبی - القاگر شیمیایی به همراه سیتوکینها - سیتوکینها به همراه انتقال ژنی] 81، 82[. تیمارMSCs باisobutylmethylxanthine و AMPDibutyrylcyclic که از عوامل افزایش دهنده cAMPدرون سلولی میباشند، موجب تمایز این سلولها به سلول عصبی میگردد ]83.[Woodburyدر سال 2000 سلولهای بنیادی مزانشیمی انسان و موش صحرایی را در محیط کشت تا بیش از 20 پاساژ پیش برد و سپس سلولها را در معرض محیط کشت فاقد سرم و حاوی بتامرکاپتواتانول (BME) یا دیمتیل سولفوکسید و butylatedhydroxyanisol قرار داد، این سلولها فنوتیپ سلول عصبی را نشان دادند و بدین ترتیب حدود 80% از سلولهای کشت شدهNSE[27]وNF-M[28]را بیان کردند]78،84.[ مطالعات Sanchez-Ramosو همکارانش نشان داد که MSCs انسان دارای ظرفیت تمایز به سلولهای عصبی میباشند. در این تحقیقات از اسید رتینوئیک، فاکتور رشد اپیدرمی(EGF)[29] و BDNF[30]، جهتتمایز سلولهای استرومایی به سلولهای عصبی استفاده شد که به دنبال آن تعدادی از سلولها، مارکر عصبی NeuN[31](حدود 5%) و تعدادی دیگر مارکر آستروسیتی GFAP[32](حدود 1%) را دو هفته بعد از کشت بیان کردند]78[.متعاقبا همکشتیMSCs با سلولهای مزانسفالیک جنینی، تعداد سلولهای تمایز یافته را به حداقل دو برابر افزایش میدهد]51،78 [. MSCs وقتیبا سایتوکینهای متفاوتی مثل EGFو bFGFهمراه میشوند دچار تغییرات دراماتیک شده، به سلولهای شبه عصبی تمایز مییابند و مارکرهای خاصنورونی مثل نستین، نوروفیلامنتها، MAP-2[33]، βIII-tubulinوNeuNرا به میزان بالایی بیان میکنند]4[. علاوه بر این،همکشتی MSCs و سلولهای بنیادی عصبی بالغ ((NSCو تزریق این سلولها به داخل مغز حیوان، منجر به بلوغ بیشتر این سلولها و تمایز آنها به سمت سلولهای نورونی و گلیالی بالغ میشود] 4،85،86[. در تحقیقات اخیر گزارش شده است که، همکشتی MSCsبا سلولهای شوان، تمایز به نورون را در این سلولها القا میکند ]87[. حتی MSCsکه در مراحل اولیهتمایز نورونی هستند(neural-primed MSC) برای تمایز نهاییشان با آستروسیت]85،86[ یا سلولهای شوان همکشتی شدند ومورفولوژی نورونی یا آستروگلیالی بالغ را نشان دادند]4.[ همکشتی بین MSCs و NSCsجسم مخطط مغز میانی[34] جنین ، باعث تمایز NSCsبه سلولهای بیان کننده آنتی ژنهای عصبی Nestin، Tuj1و GFAPشده است[88]. Jiangو همکارانش در سال 2002 گزارش دادند که در اثر هم کشتی MAPCsبا آستروسیتهای اولیه، نورونهایی ایجاد میشوند که خصوصیات یک نورون کارا مانند تولید پتانسیل عمل و بیان کانالهای سدیمی را نشان میدهند. این سلولهای MAPCsهمچنین قادرند تیروزین هیدروکسیلاز(TH)[35]، دوپامین و دوپا دکربوکسیلاز را همانند نورونهای دوپامینرژیکدر in vitroبیان کنند [89]. Jinو همکارانش در سال 2008 گزارش دادندکه همکشتی MSCsبا سلولهای پیشساز عصبیجنینی E13.5))بیان THرا در NSCsجنینی افزایش میدهند.افزایشبیانTHبه علت ترشح فاکتورهای رشد عصبی مانند NGF[36]، BDNFاز MSCsمیباشد[90]. مشابه به همین نتایجنیزدر همکشتی سلول PC12با MSCs مشاهده شده است [91]. Dezawaو همکارانش از روش ترانسفکت کردن MSCsباNICD[37] ( دمین داخل سلولیگیرنده (notchبرای تمایز این سلولهادر in vitroاستفاده کردند. notchیک پروتئین عرض غشایی بزرگ است که نقش وسیعی در تکامل دارد.MSCs ترانسفکت شده با NICD، با فاکتورهایbFGF، فورسکولین و CNTF [38]تیمار شدند و بعد از پنج روز مورفولوژی شبه نورونی نشاندادند. این سلولها پس از تقسیم میتوز مارکر MAP2را بیان میکنند. القا این سلولها با فاکتور GDNF[39]باعث تولید سلولهای TH مثبت و دوپامینرژیک میشود [92]. 1-4 کاربرد درمانیسلولهای بنیادی مزانشیمی سلول درمانی، پیوند سلولهای بنیادی خود فرد یا شخص دیگری به صورت انتقال موضعی یا تزریق سیستمیک را شامل میشود. اساس سلول درمانی این است که سلولهای تمایز نیافته به محل آسیب دیده انتقال داده می شوند. این سلولهاقادرند به ناحیه صدمه دیده مهاجرت کرده و تحت سیگنالهای موضعی به سلولهایی با فنوتیپ مورد نظر تمایز یابند .این سلولهای تمایز یافته، برای ترمیم بافت آسیب دیده همکاری می کنند]12[. نتایج بررسیهای گوناگون نشان داده است که سلولهای استرومایی مغز استخوان، سلولهای مناسبی برای تمایز به سلولهای عصبی بوده و دارای کارایی لازم برای انجام تحقیقات درمانی خصوصاً در درمان بیماریهای تخریبی سیستم عصبی از طریق روش‌هایی چون سلول درمانی و ژن درمانی میباشند[4،14،78،93]. مزیت استفاده از MSCsدر برابر انواع دیگری از سلولها در سلول درمانی شامل در دسترس بودن، توانایی تکثیر، قابل پیوند بودن و توانایی تنظیم سیستم ایمنی بدون محدودیت اخلاقی است ]4[. توانایی تمایز سلولهای MSCsبه رده سلولهای عصبی درشرایط آزمایشگاهی و بعد پیونددر موشهای سوری و صحرایی، توسطSanchez-Ramos و همکارانش ارزیابی شد و نتیجه گرفتندکه ممکن است این سلولها در درمان بیماری پارکینسون، استروک و تراتوما نیز مناسب باشند]12،76[. علاوه بر این اخیراً توسط Mezy گزارش شده است که سلولهای بنیادی مغز استخوان انسان بالغبعد از پیوند، وارد مغز میشوند و به نورون تمایز مییابند]94[. مثالهای دیگری از استفاده درمانی MSCsگزارش شده است که شامل ترمیم عروق قلبی، درمان فیبروز ششی، صدمات نخاعی، ترمیم استخوان و غضروف میباشد]12[. MSCs وقتی به درون مغز جنینموش صحراییبه صورت داخل بطنی تزریق میشودبه طور نرمال نمیتوانند از سد خونی- مغزی عبور کنند. این سلولها قادرند زنده بمانند، مهاجرت کنند و به سلولهای نوروگلیا تمایز پیدا کنند]4[. علاوه بر این بهبود کارایی همراه با پیوند این سلولها به ناحیه آسیب دیده در مدل حیوانی با بیماری پارکینسونی، آسیبهای ایسکمی- هیپوکسی نورونی و صدمه شبکیه چشم نیز مشاهده شده است.] 95[. سلولهای MSCمیتوانند به راحتی خود را با شرایط جدید سازش دهند به طوری که میتوان آنها را از شرایط in vitro به محیط in vivoمنتقل کرد و از قدرت مهاجرت بالایی برخوردارند [96].مهاجرت سلولها به محل ضایعه بستگی به پاسخ سلولهای التهابی دارد. بیان مولکولها چسبنده[40] و گیرندههای مربوط به آنها توسط سلولهای التهابی مانند نوتروفیل‌ها و مونوسیتها، باعث میشود این سلولها بتوانند از سدخونی-مغزی گذشته و به سمت ضایعه هدایت شوند. بنابراین در هر ضایعه مغزی که با پاسخ التهابی همراه است مانند پارکینسون و مالتیپل اسکلروز، براساس چنین مکانیسمی سلولهای MSCبه سمت ضایعه مهاجرت میکنند [97]. علاوه بر این، عوامل دیگری که در مهاجرت سلولهای بنیادی مزانشیمی نقش مهمی دارند SDF-1 و گیرنده آن CXCR4 میباشد.طی آسیب، شیب غلظتی از سایتوکینها مانند SDF-1و HGF از بافت آسیب دیده ایجاد میشود که بقا، تکثیر و مهاجرت سلولهای بنیادی مزانشیمی را افزایش میدهند و باعث مهاجرت این سلولها به مناطق آسیب دیده میشوند ]98،99،100[. علاوه بر مزیت MSCsدر سلول درمانی،احتمال دوم در نقش درمانی این سلولها، تولید فاکتورهای رشد توسط این سلولهاست. MSCsخود منبعی از فاکتورهای نوروتروفیک در بافت صدمه دیده است که ترمیم را تحریک میکنند]78[. طی تحقیقات اخیر گزارش شده است که MSCsتوانایی تولید NGFوBDNFرادر شرایط کشت دارا هستند که با استفاده از تکنیک الایزا و RT-PCRوجود این فاکتورها در محیط کشت تایید شده است ]101-103.[کشت MSCsدر محیط DMEMمنجربه ترشح فاکتورهای نوروتروفیکBDNF،GDNF، NGFوNT3 میشود ]78[.MSCs چندین ژن مربوط به فاکتورهای نوروتروفیک را بیان میکنند که شامل: NGF، BDNF، CNTFوIGF-1[41]میباشد و منجر به تحریک بقاء سلولهای نوروبلاستوما و نوروژنزیس در in vitroمیشوند] 104، 105[. این نتایج نشان میدهد که MSCsتوانایی تولید فاکتورهای نوروتروفیک و حفاظت از بافت آسیب دیدهرا در شرایط کشت استاندارد دارا هستند. به همین دلیل به نقش درمانیشان در حفاظت از سیستم عصبی مرکزی[42] بیشتر تاکیدمیشود]78[. پیوندMSCs در ترمیم سیستم عصبی مرکزی اولین بار توسط Chenو همکارانش گزارش شد. طی این تحقیق،MSCs به همراه BDNFبه مدلی از انسداد شریان مغزی[43] موش صحرایی پیوند زده شد و مشاهده شد پیوند ترکیبی ازMSCs و BDNFبه مدل موش صحرایی بقا و تمایز MSCsرا افزایش داده و باعث بهبود کارایی میشود. بنابراین پیوند MSCsبه همراهفاکتورهای نوروتروفیک میتواند یک روش درمانی بسیار موثری در درمان بیماریهای نورولو ژیکیباشد]106،107[. طی تحقیقی دیگر، MSCsبالغ در حضور NGFو BDNFکشت داده شد. پس از تزریق این سلولها درون مغز موش صحراییبالغ باعث افزایش سلولهای پیوند زده شده در مجاورت ناحیه صدمه دیدهشدند و فانکشن حرکتیرا بهبود بخشیدند و تعدادی از این سلولها به مارکرهای نورونی وآستروسیتی پاسخ مثبت دادند. این گروه همچنین تاکید بر نقشفاکتورهای نوروتروفیک در بهبود مغز آسیب دیده موش صحرایی داشتند] 108،109[. تزریق MSCsبه مدل استروک پس از یک ماه منجر به اثرات مثبتی مانند کاهش ضخامت اسکار یا التهاب بافتی، افزایش تکثیر سلولهای درونزا و سلولهای پیشساز الیگودندروسیت و افزایش بیانSCFو رسپتور مربوط به آن بر روی سلولهایMSC در ناحیه مرزی ایسکمی میشود. همچنین تزریق داخل شریانی کاروتید در این مدل بطور بارزی منجر به جوانه زدن عروق، بیان سیناپتوفیزین و افزایشتعداد سلولهای پیش ساز الیگودندروسیتی در جسم مخطط (corpuscallosum)و تولید دوباره آکسون-میلین گردید]109،110،111[. MSCsهمچنینبه مدل موش صحرایی با آسیبنخاعی پیوند زده شد و توسط ردیابی با رنگ آمیزیایمنوفلورسانس GFPبررسی شد. با این روش مشخص شد این سلولها به محل صدمه مهاجرت کرده و بعد از پیوند، برخی از این سلولها مارکر نورونی و آستروسیتی را بیان میکنند ]109،112[. Chen و همکارانش MSCs انسان را در محیط کاندیشنال (شرطی)بافت آسیب دیده مغز کشت دادند و گزارش دادند که میزان فاکتورهای نوروتروفیک NGF، BDNF،HGFوVEGFدر محیطکشت افزایش مییابد که با استفاده از تکنیک الایزا افزایش بیان این فاکتورها در تایید شده است] 78،113[. افزایش بیان NGFوBDNF در مغز آسیب دیده بعد از تجویز داخل عروقی سلولهای استرومایی در شرایط پاتولوژی در in vivo نیز مشاهده شده است ]114 .[محیط کشت یا بافت مصدوم،سلولهای استرومایی پیوند زده را با دو روش مختلف تحت تاثیر قرار میدهد: با القا تولید فاکتور رشد یا تحریک تمایز سلولهای پیوند زده شده به سلولهای نورونی یا گلیالی]78[.بنابراین سلولهای استرومایی مغز استخوان در محل پیوند، علاوه بر آنکه قادرند تحت تأثیر فاکتورهای القایی از محیط تمایز یابند، خود این سلولها نیز فاکتورهای رشد را در محل پیوند آزاد کرده و بدین ترتیب نقش نوروپروتکتیو دارند [115].به‌دنبال ترشح این فاکتورها قابلیت مغز افزایش یافته و با مکانیسمهای آنژیوژنز، نوروژنز و سیناپتوژنز و کاهش آپوپتوز، باعث ترمیم بافت آسیب دیده و در نهایت بهبود کارائی بیمار خواهد شد [109]. 1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی(NTFs)[44]و ساختمان مولکولی گیرندههای مربوط به آنها 1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک طی تحقیقات انجام شده، Cajalوهمکارانش بر این عقیده بودند که مهاجرتنوروبلاستها در طی تکامل سیستم عصبی در اثر تولید مواد شیمیایی است که توسط بافت هدف تولید میشود این حالت را نوروتروپیسم یا کموتروپیسم نامیدند]116 .[بدنبال این فرضیات، Levi-Montalciniوهمکارانش ]117[ پی بردندکه روند تکوین سیستم عصبی جنین جوجه با ﺣﺬف جوانه اندام[45] تغییر پیدا کرده، بقا و اندازه نورونهای گانگلیون سمپاتیک توسط سوبسترای پلیپپتیدی بنام فاکتور رشد عصبی NGFافزایش پیدا میکند. این فاکتور در برخی تومورهای بدخیم، سم مار و غدد بزاقی شناسایی شد. این محققین ثابت کردند که مرگ نورونی در دوره تکوین جنینی پدیدهای طبیعی است و طبق فرضیه فاکتورهای نوروتروفیک طی تکوین نورونی، میزان بقاء نورونی وابسته به این است که میزان کافی از فاکتورهای نوروتروفیک در دسترس نوروبلاستها باشد. نورونهایی که به میزان کافی این فاکتورها را دریافت نکنند از طریق آپوپتوز از بین میروند ]116،118[. فاکتورهای نوروتروفیک، خانوادهای از فاکتورهای رشد پپتیدی هستند که در تکوین و بقاء سیستم عصبی مرکزی ضروری میباشند. در طی دهه اخیر مشخص شدکه عملکردشان علاوه بر بقاء، شامل تنظیم رشد آکسونی و دندریتی، سیناپس، مهاجرت سلولی، تکثیر سلولی، پلاستیسیتی و بقاء نورونهای بالغ میباشد] 119[.این مولکولها به طور معمول پروتئینهای کوچک و قابل حل با وزن مولکولی 13-24 کیلودالتون میباشند و اغلب به صورت هومودایمر فعال میشوند.یک نورون فاکتورهای نوروتروفیک را از روشهای مختلفی به دست میآورد که میتوان به فاکتورهای نوروتروفیکمترشحه ازبافت هدف نورونی یا غیر نورونی، نورونهای مجاور به صورت پاراکرین یا به صورت اتوکرین توسط نورون اشاره نمود] 120.[ 1-1-5-1 انواع فاکتورهای نوروتروفیک: خانواده فاکتورهای رشد عصبی: شاملNGF،BDNF،GDNF،NT3 وNT4/5 میباشد. این خانواده به طور کلی نوروتروفینها نامیده میشوند. حضور مداومی ار نوروتروفینها در تکوین سیستم عصبی مرکزی(CNS)جایی که شکلگیری سیناپس و پلاستیسیتی وسیعی صورت میگیرد مورد نیاز است. این فاکتورها قادرندبقاء، مورفولوژیو تمایز نورونها را حفظ کنند ]121.[ NGF اولین فاکتور نوروتروفیکی است که شناسایی شد.این فاکتور در سیستم عصبی محیطی[46] (PNS) بر روینورونهای سمپاتیک عمل میکند.در CNSبقاء وعملکرد نورونهایکولینرژیک در بخش قاعدهای مغز پیشین[47] که به هیپوکمپ عصب دهی میکند را تحریک میکند. این نورونها به شدت به NGFکهتوسط بافت هدفشان یعنی نورونهای واقع در هیپوکمپ و نئوکورتکس،تولید میشود حساس هستند که و اعتقاد بر این است که پروسه آلزایمر را تحت تاثیر قرار میدهند]122،123[. BDNFو NT3بطور گستردهایدر ساختارهای هیپوکمپ و قشری بیان میشوند]123[، همچنین بقاء نورونهای حسی گانگلیونها را حمایت میکنند]124[.NGF وBDNF بقاء و تمایز نورونهایکولینرژیک رادر شرایط آزمایشگاهی تحریک میکنند]116[. BDNFهمچنین بقاء نورونهای دوپامینرژیک در حال تکوین را در جسم سیاه[48] تحریک میکند.بطور مثال ژن BDNFدر بسیاری از نواحی CNSبالغ مانند جسم مخطط بیان میشود و بطور بارزی در شرایط سمیت با MPP+[49]در کشت نورونهای مزانسفالون جنینی کاهش پیدا میکند] 116 ،125[. نورونهای گانگلیونtrigeminalموش بهNGFوBDNFدر مراحلمختلفی از تکوین پاسخ میدهند. برای مثال NGFوBDNF، رشد آکسونی را در نورونهای گانگلیون ریشه پشتی[50] (DRG) تحریک میکنند] 123،126[. NT3 دربقا و تمایز نورون های CNSوPNS نقش دارد و بعد از آسیب نخاعی، ترمیم آکسونیرا افزایش میبخشد] 119[.طی تحقیقات دیده شده است کهنورونهای حرکتی نخاعی، ترمیم آکسونیرا افزایش میبخشدطی تحقیقات دیده شده است کهنورونهای حرکتی نخاع با ترشح اتوکرینNT3 و BDNF فعالیت خود را تنظیم میکنند] 127.[ خانواده TGFβ: اعضای مهم این خانواده شامل: GDNF ، نورتورین[51]، آرتمین[52]و پرسفین[53]میباشند]118،119.[ GDNFاولین بار در سال 1993 به عنوان فاکتور رشدی که موجب بقا نورونهای دوپامینرژیک مغز میانی جنین میشود، شناخته شدند. GDNFو لیگاندهای وابسته به آن موجب حفظ به موجب حفظ سلولهای عصبی دوپامینی مغز میانی و نورونهای حرکتی CNSمیشود]128[. اهمیت GDNFبه دلیل کاربرد کلینیکی آن میباشد که از نورونها در هر دو شرایط in vivoوin vitro در برابر توکسین های مختلفی در مدلهای حیوانی پارکینسونی محافظت میکند.این فاکتور به عنوان یک واسطه درمانی موثر در بیماریهای نورونهای حرکتی مثل آمیولترال اسکلروزیس (ALS)] [54] 129[، پارکینسون]130[ و صدمات نخاعی] 131[کاربرد دارد. خانواده Neuropoietin از اعضای این خانواده میتوانLIF [55]، CNTF، IL-6 [56]،کاردیوتروفین -1 و Oncostatin- Mرانام برد]118،127 .[این خانواده عملکردهای مختلفی بر روی سلولهای سیستم عصبی دارند ویژگیهای CNS مانند فنوتیپ نوروترنسمیتر، تمایز و تکوین نورونی و گلیالی و محافظت نورونها از مرگ سلولی القا شده با آکسوتومی را در طی تکوین جنینی و در زمان بلوغ تنظیم میکنند ]127،132[. فاکتور رشد با منشا غیر نورونی: از اعضای این خانواده میتوان فاکتور رشد فیبروبلاستی اسیدی (aFGF)و بازی (bFGF) فاکتور رشد اپیدرمی (EGF)وفاکتور رشدشبه انسولینرا نام برد] 127[. 1-5-2 گیرندههای مربوط به فاکتورهای رشد عصبی نوروتروفینها، فاکتورهای رشد پلیپپتیدی عضوی از خانواده NTFsهستند که از لحاظ ساختاری بسیار شبیه به هم هستند. نوروتروفینها بقا، تکثیر، تمایز و میلینه شدن نورونها را تحریک کرده، در رشد زوائد نورونی (آکسون و دندریتها) و ایجاد سیناپس نقش دارند و آپوپتوز را در نورونها کاهش میدهند. این فاکتورها اثراتشان را از طریق اتصال به دو گیرنده مختلف، گیرنده تروپو میوزین کینازی (Trk) و گیرنده P75 NTR اعمال میکنند. گیرنده P75متعلق به زیر خانواده فاکتور نکروز توموری میباشد و اولین بار به عنوان گیرندهNGF شناساییشد.خانواده گیرندههای Trkشامل TrkA(گیرنده(NGF،) TrkB گیرندهBDNF، NT4/5)،TrkC (گیرنده NT3) میباشد. در برخی از موارد گزارش شده که NT3 به TrkAو TrkB نیز با تمایل اندکی متصل میشود و همه نوروتروفینها با تمایل یکسانی به گیرنده P75 NTRمتصل میشوند ]133[. 1-5-2-1 ساختارگیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین P75NTRپروتئین داخل سلولی از خانواده رسپتور نکروز توموری [57](TNFR) است که تشکیل شده از بخش خارج سلولی غنی از سیستئین، یک بخش درون غشایی (عرض غشایی)و یک بخش داخل سیتوپلاسمی به نام دمین مرگ که روند آپوپتوز را در سلولها اعمال میکند (شکل.1-1). P75NTRبر خلاف گیرنده TNFفاقد بخش کاتالیک در بخش سیتوپلاسمی میباشد اما با پروتئینهای متعددی واکنش میدهد و سیگنالهای مهم برای تمایز و بقاء نورونی را فعال میکند.P75 به عنوان اولین رسپتور با تمایل بالا به NGFشناخته شد، اما بعدها متوجه شدند که این گیرنده با تمایل یکسانی به تمام نوروتروفینها متصل میشود. عملکرد گیرنده P75پیچیده و متنوع است، زمانیکه با گیرنده تیروزین کینازی (Trk)به طور همزمان بیان شود در فانکشنهای بقاء، تمایز، افزایش رشد دندریت نقش داشته و باعث تکثیر و تمایز میشود] 133[،به هر حالاین گیرنده ممکن است نقش مهمی در میلینه شدن داشته باشد]134[. مسیر پیام رسانی توسط P75NTR، منجر به تولید سرامید،NF-KB [58]و JNK[59] میشود.این گیرندهدر شرایط مرگ سلولی، التهاب یا استرس در سیستم عصبی، به عنوان گیرنده مرگ سلولی عملمیکند]122،135[. نوروتروفین ابتدا به صورت پیشساز پروتئینی به نام پرونورو- تروفین ساخته میشود سپس بریده شده و به نوروتروفین بالغ تبدیل میشود. فعالیت بیولوژیک یک نوروتروفین با شکست پروتئولیتیک نوروتروفین آغاز میشود و به شکل پرو- نوروتروفین مسیر آپوپتوزی را با واسطه P75NTR فعال میکند و به شکل بالغ به رسپتور تیروزین کینازی متصل و بقاء سلولی را تحریک میکند] 122،136[. طی تحقیقی بر روی سلولهای A875،اتصالNGF به صورت پرونوروتروفین (pro-NGF) و نوروتروفینبه گیرنده P75NTRمقایسهشد و مشاهده شد که پرونوروتروفین NGFحتی در غلظتهای کم، مرگ سلولی راآغاز میکند] 133،137[. در مطالعات in vivo، pro-NGF از طریق گیرندهP75باعث مرگ سلولهای الیگودندروسیت در مدل آسیب نخاعی و آپوپتوزنورونهای قشری نخاعی در مدل آسیب مغزی میشود]133[. یکی از مسیرهای مهمی که توسطP75NTR فعال میگردد مسیر JNKمیباشد. فعال شدن JNKاز طریق میان کنش TRAF6[60]با P75NTRدر نهایت منجر به آپوپتوزسلول میشود. علاوه بر TRAF6در فعال شدن مسیر JNK، چندین پروتئین دیگر نیز مانند NRIF[61] وNRAGE [62] با در بخش سیتوپلاسمی واکنش داده و مسیر مرگ سلولی را فعال میکنند] 133[. اتصال نوروتروفین به گیرنده P75NTR سبب فعال شدنNF-kBمیشود که بقاء نورونی را با واسطه NF-kBتحریک میکند.شروع این مسیر پیام رسانی، به چندین پروتئین شاملTRAF6، p62وRIP2[63]نیاز دارد. فعال شدن این مسیر در پاسخ به نوروتروفین سببانتقال NF-kBبههسته و شروع بیان Hes1/5شده و رشد دندریت را تنظیم میکند]133[. یکی از نقشهای دیگر P75NTRتنظیم رشد اکسونی است. .RhoAعضوی از خانواده پروتئینی Rho میباشد که سازماندهیاکتین اسکلت سلولی را در تیپهای مختلف سلولی کنترلمیکند.در غیاب نوروتروفین میان کنش بین P75NTRوRhoA، فعالیت RhoAرا حفظ کرده و رشد آکسونی را مهار میکند. با اتصال نوروتروفین، RhoA از رسپتور جدا شده و باعث رشد آکسونیمیشود] 133،138[. بنابراین نوروتروفینهای بالغ و نابالغ با اتصالبه P75NTRسه مسیر رافعالمیکنند: بالغ و نابالغ با اتصالبه P75NTRسه مسیر رافعالمیکنند: با فعال کردنNF-KB باعث بقای نورون و با فعال کردنJNKباعث مرگ نورونی میشوند و با تنظیم پروتئین RhoA رشد آکسونی را کنترل میکنند] 121[. شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTRتنظیم میشود. اتصال نوروتروفین نابالغ و بالغ به این رسپتورمسیرهای سیگنالینگ متفاوتی مانند بقا، آپوپتوز سلولی و رشد آکسون را تنظیم میکند. 1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین رسپتور Trk از خانواده گیرندههای تیروزین کینازی است که از یک بخش خارج سلولی دارای سه موتیف غنی از لوسین با دو زنجیره سیستئینی حاوی دو دمین C2- شبه ایمنوگلوبین (Ig-C2)، یک بخش عبور کننده از عرض غشا و یک ناحیه سیتوپلاسمی با بخش کینازی تشکیل شده است (شکل1-2). اتصال نوروتروفینها به گیرنده تیروزین کینازی بطور اساسی از طریق بخش Ig- C2 صورت میگیرد] 133،139[. شکل 1-2.نوروتروفینها و گیرندههای مربوط با آن: رسپتور تیروزین کیناز و .P75NTRنوروتروفینها به صورت دایمر و با تمایل یکسانی به گیرنده p75)متعلق به خانواده گیرنده نکروز توموری( و به طور اختصاصی به رسپتور تیروزین کیناز خاص خود متصل میشوند. Trkرسپتور پروتیپیک تیروزین کینازی استکه با اتصال نوروتروفین دایمریزه شده و محل اتصال نوروتروفین به لیگاند را فعال میکند. با اتصال نوروتروفین به رسپتور تیروزین کیناز مسیر پیام رسانی[64] شروع میشود و سبب اعمال متعددیمانند بقاء، تمایز، افزایش انشعابات دندریتی، شکلگیری سیناپس، پلاستیسیتی، رشد آکسونی و جهتیابی آکسونبهسمتنورونهای هدف میشود]133[. اتصال نوروتروفین به این رسپتورمنجر به دایمری و فسفوریله شدن گیرنده میشود، این وقایع بین همهی گیرندهها مشترک است. نوروتروفینها مسیر انتقال پیام مشترکی دارند. فسفریله کردن تیروزین یک بستری را برای فعال کردن پروتئینهای مسیرپیام رسانی فراهممیکند (شکل.1-3). این پروتئینها سبب فعال کردن مسیر[65]ERK/[66]MAP kinase یا PI3-K[67]/AKT و PLCγ، در بخش سیتوپلاسمی میشوند]119،133[. کمپلکس نوروتورفین-رسپتور به داخل سلول وارد شده و در مسیر معکوس به جسم سلولی منتقل میشود. در آنجا بر روی فاکتورهای نسخه برداری اثر میﮔﺬارد و منجر به بیان و سنتز ژن فاکتورهای نوروتروفیک، تمایز، بقا و پلاستیسیتی سیناپس میشوند] 133[. شکل 1-3. مسیرهای پیام رسانی با واسطه Trkتنظیم میشود. اتصال نوروتروفین به گیرنده سبب فعال کردن پروتئینهای متعددی در بخش سیتوپلاسمی میشود که با فسفریله کردن این پروتئینها همراه استاین اتصال مسیرهای پیام رسانی متعددی مانندRas، PI3KوPLCγ را فعال میکندکه منجر به بقا، رشد دندریت، بیان ژن و پلاستیسیتی سیناپس میشود. توانایی این NTFsدر بقاء سیستم عصبی مرکزی و محیطی در طی تکامل و بعد از صدمه نورونی، منجر به این شد که این مولکولها به عنوان یک واسطه درمانی موثر برای درمان صدمات عصبی و بیماریهای نورودژنراتیو مورد توجه قرار گیرند. اکثر این ترکیبات اثرات فارماکولوژی را روی انواع خاصیاز نورونها اعمال میکنند. بنابراین به عنوان یک واسطه درمانی مناسبی برای درمان بیماریهای نورودژنراتیو انتخاب شدند. برای مثال در انسان برای درمان بیماریهای نورولوژیکی مختلفی مانند آمیولترال اسکلروزیس از CNTF و BDNF، آلزایمر از NGFو پارکینسون از GDNFاستفاده شده است. بطور مثال طی تحقیق بر رویموش مدل پارکینسونی نشان داده شد که NTFsمانند GDNFآپوپتوز نورونی را کاهش و بقاء نورونهای دوپامینرژیکی را در شرایط آزمایشگاهی افزایش میدهد] 116[. 1-6 سلولهای بنیادی عصبی 1-6-1 نوروسفر سلولهای بنیادی عصبی(NSCs) به عنوان سلولهای تمایز نیافته تعریف میشوند که قادر به خود تکثیری هستند و به سه رده سلولی تشکیل دهنده سیستم عصبی مرکزی، شامل نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت تمایز پیدا میکنند ( شکل.1-4) ] 140[. جداسازی سلولهای بنیادی عصبی، نخستین بار توسطReynolds و Weissدر سال 1992 از CNSموش گزارش شد سپس در سال 1999 توسط Kukekovو همکارانش از CNSانسان استخراج شد] 141،142[. شکل 1-4. سلولهای بنیادی عصبی و ردههای سلولی مربوط به آن. پر توان بودن یک سلول بنیادی عصبی منفرد با تولید سلولهای پروجنیتور، شامل سلولهای پروجنیتور عصبی neuronal progenitor cells (NP)و سلولهای پروجنیتورprogenitor cells (GP)glialنشان داده شده است. در سیستم عصبی مرکزی در نواحی[68]SVZ واقع در دیواره جانبی بطنهای جانبی مغز قدامی، [69]SGZواقع در شکنج دندانهای[70]هیپوکمپ نورونزایی به طور پیوسته در طول حیات رویمیدهد] 143[. رایج ترین روش کشت سلولهای بنیادی عصبی روش کشت سوسپانسیون است. در این روش سلولهای پیشساز عصبی به صورت ساختار کروی شکل به نام نوروسفر، تکثیر پیدا میکنند. معمولا نوروسفر از سلولهای پروجنیتور یا سلولهای بنیادی عصبی سیستم عصبی مرکزی بالغ یا جنینی به صورت سوسپانسیون تک سلولی جدا میشود] 144،145[.این سلولها را میتوان در محیطDMEM/F12]144،146[،DMEMوNeurobasal]49[، در حضور N2] 147،148 [یاB27 ]149،150 [درحضور EGFو FGF]146،149،151[کشت داد. حتی کشت این سلولها در محیط -MEMαو در حضور سرم نیز گزارش شده است ]152[.محققین از روش کشت NSCsبه صورت نوروسفر به عنوان روش مناسب برای نشان دادن ویژگی خود تکثیری و توانایی ایجاد ردههای متعدد عصبیاستفاده میکنند (شکل 1-5)] 145 .[ شکل1-5. ارزیابی شکلگیری نوروسفر. یکی از روشهای اصلی محققین برای شناخت بیولوژی سلولهای بنیادی در سیستم عصبی مرکزی، تکثیر این سلولها به صورت کلونی در کشت شناور و محیط حاویEGF و FGF2میباشد که کشت نوروسفر نامیده میشود. نوروسفری که از یک تک سلولی جدا میشود قادر است به سه رده اصلی سلولی سیستم عصبی مرکزی مانند نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت تمایز یابد. این ساختار کروی هتروژن در بستری از ماتریکس خارج سلولی قرار گرفته و ساختار سه بعدی را تشکیل میدهند که حاوی تعدادی سلولهای پیشساز عصبی و تمایز یافته و مقادیر قابل توجهی از βاینتگرین، گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی و کادهرینها میباشد]141[. در این ساختار سه بعدی، سلولهای مرکزی نوروسفرها تمایز یافته بوده وGFAP+ و tubulin+ βIII-هستند، ولی سلولهای بخش محیطی نوروسفرها، سلولهای تمایز نیافته بوده و Nestin+ EGFR+ و β+ اینتگرین میباشند]153[.NSCs به دو شکل تک لایه[71]چسبنده و سوسپانسیون کشت داده میشوند. ReynoldsوWeissواکثر گروههای دیگر این سلولها را به صورت نوروسفر در سوسپانسیون کشت میدهند]144،154[. Zhengو همکارانش دو روش کشت NSCsبه صورت سوسپانسیون و تک لایه چسبنده را برای تکثیر طولانی مدت با هم مقایسه کرده و مشاهده کردند که NSCs در کشت به صورت سوسپانسیون مارکر نستین و در کشت به صورت تک لایه چسبنده، مارکر βIII- tubulin را به میزان بالایی بیان میکنند. این نتایج نشان داد کهNSCsهاییکه به صورت سوسپانسیون کشت شدند تقسیم متقارن را نشان داده و دارای توانایی تکثیر بالایی هستند و موجب حفظ نسبت بالایی از سلولهای بنیادی میشود. سلولهای پیشساز که از تقسیم سلولی نامتقارن خارج میشوند در کشت چسبنده به سلولهای بیان کننده βIII- tubulinتمایز پیدا میکنند.بنابراین کشت تک لایه چسبنده، تمایز نورونی راالقا میکند و در کشت سوسپانسیون ویژگی بنیادی بودن خود را حفظ میکنند] 155[. یکی از روشهای کشت نوروسفر روش NSA[72] میباشد که در سال 1992 آغاز شد، NSAبرای جداسازی سلولهای بنیادی عصبی از سیستم عصبی مرکزی و پرداختن به خصوصیات اساسی سلولهای بنیادی مانند خود تکثیری و توانایی تمایز به رده سلولی تمایز یافته و کارا میباشد. تلاش محققین برای کشت و تکثیر سلولهای بنیادی مغز بالغ منجر به این شد که ReynoldsوWeissسیستم کشت فاقد سرم را برای کشت NSCsبه کار گیرند. بدنبال این روش کشت، سلولهای اولیه و تمایز یافته سیستم عصبی مرکزی باقی نمانده و از بین رفتند در حالیکه کشت فاقد سرم منجر به مرگ سلولهای بنیادی عصبی شد اما درصد کمی از این سلولها (1/0%) که به EGF پاسخگو بودند وارد فاز تکثیری شدند. بنابراین این محققین نشان دادند که یک سلول منفرد یا سلول پیشساز عصبی که از سیستم عصبی مرکزی بالغ جداسازی میشود تکثیر شده و تشکیل مجموعه سلولی تمایز نیافته و کروی شکل را میدهند که به این سلولها نام نوروسفر اطلاق میشودکه متعاقبا، این نوروسفرهای اولیه به صورت تک سلولی برای تشکیل نوروسفرهای ثانویه جداسازی میشوند یا نوروسفرها القا شده و به سه رده اصلی سلولی سیستم عصبی مرکزی تمایز مییابند. این محققین در ادامه نشان دادند که سلولهایی که با این روش کشت جداسازی میشوند ویژگیهای اصلی سلولهای بنیادی مانند تکثیرو توانایی تبدیل ب نسل تمایز یافته و کارا را دارا هستند]143[. کشت نوروسفر از سلولهای بنیادی جنینی نیز گزارش شده است. طی تحقیقاتKato و همکارانش در سال 2006، جسم مخطط جنین موش14-12.5 روزه نژاد6 / C57BLn در مدیوم نوروسفر در حضور EGFو FGF2 به مدت 7 روزکشت داده شد. اضافه کردن محیط کاندیشنال (شرطی) کشت نوروسفرهای اولیه[73] به ESCsتولید نوروسفر را در این سلولها القا میکند بدون اینکه برای تمایز سلولهای ESنیاز به سلولهای پشتیبان[74] یا FCSباشد. فاکتورهای مترشحه از نوروسفر (NDF)[75] نقش مهمی در تولید نوروسفر از سلولهای ESدارد. این نوروسفرها وقتی در محیط تمایزی قرار میگیرند در روز سوم از تمایز نشانگرهای نورونی TujوMAP2 و متعاقبا در روز هفتم مارکر GFAPو MPB [76]را بیان میکنند. همچنین در شرایط in vivo قادر به تمایز هستند بدون اینکه تشکیل تومور دهند]156[. NSCsبطور مستقیم از سیستم عصبی جنینی یا بالغ جداسازی میشود اما به دلیل مشکلات اخلاقی در استخراج NSCsازجنین یا فتوس و به علت ذخایر محدود سلولهای بنیادی درسیستم عصبی مرکزی و حتی محدودیتهایی در استخراج NSCs از بافت مغز بالغ، سلولهای پیشساز عصبی که از سلولهای بنیادی مغز استخوان جداسازی میشوند به دلایل متعددی به عنوان منبع مهمی در نظر گرفته میشوند. این سلولها به راحتی از بیمار برداشت میشوند، قابلیت و توانایی تکثیر بالا در in vitro دارند، دارای خاصیت تومورزایی محدود میباشند و همچنین به صورت پیوند اتولوگوس در درمان بیماریهای نوروپاتولوژی استفاده میشوند] 157،158.[ Kabos و همکارانش در سال 2002 تشکیل نوروسفر از سلولهای بنیادی مغز استخوان را درشرایط فاقد سرم (شرایط کشت مشابه با کشتNSCs)در کشت سوسپانسیون گزارش داد. با BMSCsاستفاده از این شرایط کشت قادرند به نورون تمایز پیدا کنند] 159[. طی تحقیقی دیگر Wuو همکارانش در سال 2003، از هم کشتی MSCs با سلولهای پیشساز نورونی یا نوروسفر گزارش دادند، به این صورت که سلولهای بنیادی مزانشیمی بالغ به همراه سلولهای نوروسفری که از نخاع جنین جدا شده بودند به صورتتک لایه چسبنده کشت داده شدند.MSCsتاثیر بسیار زیادی بر سلولهای نوروسفرکه از کشت سلولهای نخاعیبدست آمده بودند داشته است. حضور تعداد کمی از سلولهای MSCs در سیستم هم کشتی تمایز سلولهای نوروسفر به هر دو رده سلولی نورون و گلیالی را القا میکند. احتمالا فاکتورهای نوروتروفیک که از MSCsآزاد میشوندتکثیر و تمایز سلولهای نوروسفر را حمایت میکنند]160[. Hermanو همکارانش ]161[ تولید تودههای سلولی کروی از سلولهای بنیادی مغز استخوان انسان با روشی مشابه به روش استخراج NSCsحاصل از سلولهای بنیادی جنینی گزارش داند] 162[. این سلولها از لحاظ فنوتیپی و مورفولوژیکی مشابه نوروسفر هستند و در حضور فاکتورهای رشد،قادرند سه فنوتیپ اصلی عصبی آستروگلیا، الیگودندروسیت و نورون را نشان دهند. این NSCsحاصل از مغز استخوان به صورت ساختار شبه نوروسفری با روش جداسازی و تکثیر سلولهای پیشساز عصبی کشت داده میشوند]145،163[و قادر هستند میزان بالایی از نشانگرهای نورونی NeuroD1[77]، Neurog2[78]و MS11[79]به خوبی نستینبیان میکنند]161[. Neurog2و NeuroD1از ژنهای اولیه نورونی[80] هستند که برایشروع تکامل نورونی و تحریک تولید پیشسازهایی که برای تمایز نورونی متعهد میشوند ضروری هستند] 164[. Suzuki و همکارانش در سال 2004، تولید نوروسفر از MSCsرا گزارش دادند. این محققین در مرحله القاء نورونی،MSCs را درحضور القاگرهای DMSO،hydroxyanisole butylated و BMEکشت دادند، سلولها در این شرایط کشت مورفولوژی نورونی را نشان دادند و تعدادی از این سلولها به صورت تودههای سلولی شناور از کف فلاسک جدا شدند. برای شکلگیری نوروسفر، این تودههایکروی به محیطNeurobasalA به همراه N2و bFGFمنتقل شدند بعد از 15-7 روز تشکیل نوروسفر دادند. این نوروسفرها سلولهای چند توانی هستند که در مدیوم تمایزی قابلیت تمایز به فنوتیپ عصبی شامل: نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت را نشان دادند و با رنگآمیزی ایمنوسیتوشیمی به نشانگرهای نورونی Tuj-1وMAP-2،آستروسیتی GFAP والیگودندروسیتی O4پاسخ مثبت میدهند]165.[ طی تحقیقی توسط Yangو همکارانش در سال 2008، تولید نوروسفر در محیط کشت F12 DMEM/به همراهEGF،bFGFوB27ازMSCs گزارش شده است.این نوروسفرها درمحیط تمایزی به سلولهای عصبی و آستروسیتی تمایز پیدا کرده و نشانگرهای نورونیNSE، MAP-2 β-III tubulin و آستروسیتیGFAPرا بیان میکنند] 166[. علاوه بر این Xuو همکارانش در سال 2008 تولید نوروسفر را از سلولهای مزانشیمی بافت چربی در حضور EGFوbFGFگزارش دادند این نوروسفرها قادرند در محیط تمایزی سلولهای شوان حاوی RA، فورسکولین، PDGF-BB[81]و Heregulin به سلولهای شوان تمایز یابند و با رنگآمیزی ایمنوسیتوشیمی به نشانگر سلولهای شوان، مانندGFAPو S-100پاسخ مثبت میدهند] 167[. Tsengو همکارانش در سال 2006 تولید نوروسفر را از کشت طولانی مدت MSCsدر محیط IMDM[82]و سرم 10% گزارش دادند. به این صورتکه سلولهای MSCبه مدت شش هفته کشت داده شدند. بعد از کشت طولانی مدت، این سلولها به طور خودبخودی به نوروسفر تمایز یافته و از پیشسازهای نورونی نستین مثبت غنی میشوند این پیشسازهای عصبی در شرایط مناسب کشت و با کاهش سرم و به همراه N2و فاکتور رشد bFGF به نورون تمایز پیدا میکنند و نشانگرهای نورونی NF-H، β-III tubulinو تائو را بیان میکنند] 168[. Bez و همکارانش طی تحقیقی در بررسی فراساختاری نوروسفر نشان دادند که نوروسفرها دارای ساختار هتروژن هستند و نشانگرهای رده سلولهای عصبی را بیان میکنند. مطالعات با میکروسکوپ الکترونی نشان داده که آپوپتوز و نکروز در قسمت مرکزی این ساختار به علت فقدان مواد غذایی بیشتر است. علاوه بر این، سلولهای بنیادی عصبی که از این نوروسفرها خارج میشوند اندازه سلولی متفاوتی دارند و در فازهای مختلف چرخه سلولی در کنار همدیگر زندگی میکنند. وقتی یک نوروسفر روی ماتریکس کشت داده شود این سلولها ساختار کروی شکل خود را از دست داده و گسترش پیدا میکنند و به صورت تک لایه در میآیند. در لایه خارجی یکسری زوائد سیتوپلاسمی شبیه به پای کاذب از این سلولها جدا میشود] 169[. طی بررسیهای فراساختاری نوروسفر، مشخص شده که آپوپتوز بیشتر در لایههای داخلی بین لایههای دوم وسوم رخ میدهد. . نوروسفرهای بزرگتر دارای یک مرکز تیره هستند که معرف مناطق نکروتیک هستند که در اثر نکروز سلولهای درونی نوروسفر به دنبال فقر غذایی ایجاد میشود ولی در بخشهای محیطی نوروسفر که به رنگ روشن است سلولها زنده هستند و از مواد غذایی اطرافشان استفاده میکنند. سلولهای تشکیل دهنده نوروسفر هتروژن بوده و از نظر ساختار، گرانولاریتی، متابولیسم، محتویات سیتوپلاسمی و حتی چرخه سلولی با یکدیگر تفاوت دارند.وقوع پدیدههای بیولوژیکی مانند میتوز، پروسه نسخه برداری، آپوپتوز و نکروز وابسته به محل قرار گیری سلولها در ساختار نوروسفری میباشد. معمولا در سلولهایی که اطراف نوروسفرها را تشکیل میدهند ( در محیط نوروسفرها قرار دارند) وقایعی مثل میتوز و سنتز پروتئینی رخ میدهد یعنی سلولهایی که در محیط نوروسفرها قرار دارند فعالیت سلولی بسیار بالایی دارند. زمانیکه سلولهای لایه خارجیتر نوروسفر، 24ساعت با نشانگر Brduانکوبه شوند به طور فعالسنتز DNAرا نشان میدهند. ولی در مرکز نوروسفرها وقایع آپوپتوز، فاگوسیتوز، نکروز و عدم وقوع میتوز و سنتز پروتئین رخ میدهد. میزان زنده بودن سلولهای درونی نوروسفر وابسته به در دسترس بودن اکسیژن و مواد غذایی محیط کشت میباشد. در واقع نوروسفر را میتوان یک ساختار قابل سازش با ریز محیط اطرافش دانست. اینکه نوروسفرها در شرایط کشت در اندازههای کوچک و بزرگ هستند به علت حساسیت آنها به مواد موجود در محیط کشتشان است نوروسفرها در حضور فاکتور رشد پاسخ متفاوتی میدهند، به طوریکه دیده شده در کشت نوروسفرهای موش حضور EGFدر کشت باعث میشود که ضخامت کلونیهای نوروسفری بزرگتر از زمانی باشد که فقط bFGF در محیط کشت حضور دارد و نوروسفرهایی که در شرایط کشت در معرض هر دو فاکتور EGFوbFGFقرار میگیرند اندازههای بزرگ و کوچک دارند]169[. 1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی سلولهای بنیادی عصبی سلولهایی با قابلیت خودتکثیری هستند که توانایی تمایز به انواع سلولهای عصبی را دارا میباشند.در راستای ویژگیهای این سلولها در in vitro، همچنین توانایی درمانیشان در in vivo، پیوند NSCs درمدل بیماریهای متعدد، مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعات به بررسی بقا، میزان پایداری، تمایز و کارا بودن این سلولها پرداخته شد] 170.[ برای مثال نوروسفرهاییکه از SVZجداسازی شده بودند به جسم مخطط بیماران مدل پارکینسونی پیوند زده شدند. این سلولها به آستروسیت و نورونهای TH+تمایز یافته و اختلالات حرکتی را بهبود بخشیدند] 171 .[نوروسفرهایی که از CNSجنین انسان جداسازی شده بودند به قشر مخ[83] موشهای صحرایی مدل ایسکمی پیوند زده شدند و مشاهده شد که این سلولها به آستروسیت و نورون تمایز مییابند] 172[.طی تحقیقی همچنین NSCsانسان به جسم مخطط بیماران مدل هانتینگتونی پیوند زده شدند و این سلولها به آستروسیت و نورون متمایز شدند و حتی بهبود آناتومیکی و رفتاری مشاهده شد] 173[. موارد بیشتری که از نقش درمانی NSCsگزارش میدهد شامل نوروسفرهایمهندسی شده است که میتوان از آنها به عنوان حامل مولکولهای درمانی استفاده کرد که نوروپروتکشن را حمایت میکنند.برای مثال NSCs که از کشت جسم مخطط جنین موش صحرایی بدست میآید ( modify شده که GDNF را تولید میکند) به مدل بیماری پارکینسونی پیوند زده شدند و به دنبال آن بقای نورونهای دوپامینرژیک مشاهده شد] 174[. در تحقیقی دیگر نوروسفرهای جدا شده از SVZموش بالغ را به صورت داخل عروقی به مدلهای بیماری مالتیپل اسکلروز مزمن (MS)[84] تزریق کردند که به دنبال آن سلولهای پیوندی به نواحی فاقد میلین مهاجرت کرده و به سلولهای بالغ عصبی مانند الیگودندروسیتها تمایز پیدا کردند. این نوروسفرهاتخریب سلولهای آستروگلیا و دمیلینه شدن را کاهش داده و ساخت دوباره میلین و بدست آوردن کارائی را تحریک میکنند] 175[. Takagi و همکارانش گزارش دادندکه نوروسفرهایی که از سلولهای بنیادی جنینی میمون منشا میگیرند قادرند تحت القاFGF-2 وFGF-20تعداد زیادی نورونهای دوپامینرژیک ایجاد کنند. با پیوند این نورونها به مدل پارکینسونی، بهبود رفتاری در آنها مشاهده شد]176[. طی تحقیقی دیگر Luو همکارانش]177[گزارش دادندMSCهاییکه با نوروسفرهای استخراج شده از بافتمغز جنین همکشتی شوند برای پیوند و درمان در مدل بیماری TBI[85]مناسب هستند، این سلولها پس از پیوند زنده مانده و چهارده روز بعد از پیوند به دیوارهی ناحیه تخریب شده، مهاجرت کردند. این نتایج پیشنهاد میکند که سلولهای نوروسفر و استرومایی رشد یکدیگر را حمایت میکنند. بدلیل اینکه بافت مغز جنین، بسیاری از پروتئینهای تکوینی مانند فاکتورهای رشد را بیان میکند] 178[، بنابراین ریز محیط مناسب برای تکثیر، تمایز، مهاجرت و ارتباط نورونها را در طی تکوین مغز فراهم میکند ]179[. سلولهای استرومایی یکسری از فاکتورهایرشد را ترشح میکنند که برای تکثیر و تمایز سلولهای استرومایی در کشت مورد نیاز هستند ]180[. 1-7 ضرورت اهداف تحقیق سلول درمانی یکی از روشهای درمانی است که در سالهای اخیر تحقیقات گستردهای در خصوص آن انجام شده و محققین سعی بر آن داشتند که به کمک آن روش درمانی مناسبی برای ضایعات سیستم عصبی مرکزی پیدا کنند [181، 182]. سلولهای بنیادی عصبی برخلاف سایر بافتها، توانایی ترمیم محدودی دارد. از طرفی با وجود سلولهای بنیادی عصبی در داخل بافت مغز، ظرفیت تولید نورونهای فعال جدید در پاسخ به ضایعات نیز محدود میباشد [183]. بنابراین یکی از بهترین روشهای درمان، جایگزین کردن نورونهای آسیب دیده با سلولهای مناسب است [184،185]. سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بالغ، به‌عنوان مناسبترین سلول بنیادی در جهت سلول درمانی شناخته شدهاند. این سلولها به راحتی در دسترس بوده، خالصکردنشان آسان است به گونه‌ای که در شرایط کشت، به راحتی به کف فلاسک پلاستیکی می‌چسبند،پاساژهای مکرر باعث خالص شدن این سلولها درشرایط in vitro میگردد [4،12،39]، کار باآنها هیچگونه موانع اخلاقی و قانونی به‌دنبال ندارد. با توجه به آنکه سلولهای MSCازخودفرد گرفته شده و به خودش نیز پیوند زده میشوند، بنابراین پس زدن پیوند را به همراه نخواهد داشت [4،14،186]. این سلولها ژنهای رده سلولهای اکتودرمی، اندودرمی و مزودرمی را بیانمی‌کنند قدرت خود تکثیری و تمایز بالایی را در invitroدارند، به‌طوری که قادرند در شرایط invivoو invitroبه سلول عصبی تمایز یابند [4،51،78،84،93]. به علت ذخایر محدود سلولهای بنیادی در سیستم عصبی مرکزی و عدم دسترس بودن این سلولها،سلولهای مزانشیمی مغز استخوان به عنوان منبع سلولی مهمی در استخراج سلولهای پیشساز عصبیدر نظر گرفته شده است. بسیاری از گزارشات اخیر مبنی بر تولید نوروسفر در حضور فاکتورهای رشد از سلولهای بنیادی مغز استخوان میباشد. هدف ما در این پژوهش تولید نوروسفر از MSCsبدون حضور القاگر یا سایتوکیندر محیط بهکشت، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) میباشد، همچنین بررسی ظرفیت بیان فاکتورهای نوروتروفیک و بیان ژنهای اختصاصی سلولهای دوپامینرژیک (1Nurr وTH) و نشانگر سلولهای نورواپیتلیال (نستین) در این شرایط کشت توسط MSCs میباشد. در این صورت بدون استفاده از عوامل القاگر میتوان با تولید خودبخودی سلولهای پیشساز عصبی و همچنین تمایز خودبخودی MSCsبهسلولهای شبه نورونی در این شرایط کشت، با حداقل دستکاری شرایط آزمایشگاهی راهرچهبیشتربهشرایطداخلبدننزدیککرد. سوالاتی که در این پژوهش به آن پاسخ داده شد این است که: آیا MSCsدر کشت طولانی مدت قادرند به سلولهای شبه نورونی تمایز پیدا کنند؟ آیا MSCsدر کشت طولانی مدت، فاکتورهای نوروتروفیک را بیان کنند؟ آیا MSCsدر کشت طولانی مدت قادرند بدون اضافه کردن القاگر به محیط کشت ژنهای نورونی را بیان کنند؟ آیا میتوان از MSCsکه به مدت سه هفته کشت داده شدهاند بدون حضور فاکتور رشدنوروسفرایجاد کرد 1 progenitor 2 Niche 3 symmetric 4asymmetric 1 Totipotent 2 Pluripotent 3Inner cell mass 4 Multipotent 5 adult Stem Cell 6 Embryonic Stem Cell 1 Hematopoietic stem cell [12] Mesenchymal stem cell 3bone-forming progenitor cells 4 Colony forming unit fibroblasts 1 Multipotent adult progenitor cells 1 processed lipoaspirate 2 Adipose tissue –derived adult stem cell 3 In vitro 4 Stem Cell Factor 5 Stromal-derivedfactor-1 1 natural killercells [21]majorhistocompatibility complex 1 Transforminn growth factor-β1 2 hepatocytegrowth factor 3 vascularendothelial growth factor 1Neural stem cell 1 Co-culture 2 Neuron- specific enolase 3 Neurofilament- M 4 Epidermal growth factor 5 Brain-derivedneurotrophic factor 6 Neuron-specific nulear protein [32]Glial fibrillary acidic protein [33]Microtubule-associated protein-2 1 Mesoncephalon [35]Tyrosine hydroxylase [36]Nerve growth factors [37]Notch intracellular domain [38] Ciliary neurotrophic factor [39] Glial cell line- Derived Neurotrophic Factor 1 Adhesion molecules 1 Insulin growth factor 2 Central nervouse system 3 Middle cerebral artery occulotion 1 Neurotrophic Factors 2 Limb bud [46]Peripheral nervouse system [47] Basal forebrain 3 Substantia nigra 4 1-methyl-4-phenylpyridinium 5 Dorsal Root Ganglion [51]Neurturin [52]Artemin Dorsal Root Ganglion [53]Persephin [54] Amyotrophic lateral sclerosis [55] Leukemia Inhibitory Factor [56] Interleukin-6 1Tomore necrosis factor receptor [58] Tomore necrosis factor receptor [59] nuclear factor KB 1TNF receptor-associated factor-6 2 Neurotrophin receptor-interactingfactor [62]Neurotrophin receptor p75 interactingMAGE homologue 4 receptor-interacting protein-2 1Signal transduction 2extracellular signal-regulated kinases 3mitogen-activated protein kinase 4 phosphoinositide 3-kinase [68] Subventricular zone [69] Subgranular zone [70] dentate gyrus
1 monolayaer 2 Neurosphereassay [73]conditioned medium of primary neurosphere culture 2 feeder [75]Neurosphere-derived factor [76]myelin basic protein 1 Neurogenic differentiation 1 2 Neurogenin 2 3 Musashi 1 4 Proneural genes [81] platelet-derived growth factor [82] Iscoves modified Dulbecco᾿s medium [83] Cerebral cortex [84]Multiple Sclorosis [85] Traumatic brain injury |
دانلود آنتی ویروس کامپیوتر با حجم کم
 دانلود آنتی ویروس کامپیوتر با حجم کم
دانلود آنتی ویروس کامپیوتر با حجم کم
همان طور که میدانید آنتی ویروس های جدید بسیار پر حجم هستند و باعث کاهش سرعت سیستم میگردند اگر شما هم آنتی ویروس های کم حجم را به آنتی ویروس های پرحجم ترجیح میدهید پیشنهاد میکنم آنتی ویروس آویرا که فقط 6 مگابایت حجم دارد را دانلود نمایید |
حل مشکل MULTICORE CHECKSUM MODE
 حل مشکل MULTICORE CHECKSUM MODEمعمولا بعد حذف FRP توسط روش رایت از ODIN صفحه نمایش گوشی با عوارضی همچون MULTICORE CHECKSUM MODE مبتلا می شود که توسط این فایل مشکل رفع خواهد شد |
ماژول های سخن و ذکر روز برای جوملا 3
 ماژول های سخن و ذکر روز برای جوملا 3توسط این ماژول ها می توانید متن مورد نظر خود را به صورت روزانه ,هفتگی یا رندوم (تصادفی) در سایت نمایش دهید. این ماژول برای جوملا ۳ مناسب است. شما می توانید جملات زیبایی را برای کاربران وب سایتتان به نمایش بگذارید. |
