جداسازی و شناسائی اندوفیت های گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی مارچوبه بومی استان گلستان و تاثیر آنها در گیاهان

جداسازی و شناسائی اندوفیت های گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی مارچوبه بومی استان گلستان و تاثیر آنها در گیاهان چکیده اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل بخشی از زندگی خود را در گیاه به سر می برند. آنها از گیاه سود می برند و از مواد مغذی گیاه استفاده می کند و گیاه نیز به نوبه ی خود با کاهش استرس وافزایش رشد از این تعامل سود می برد. در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادر هستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. در این مطالعه به جداسازی اندوفیت های سه گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه پرداخته شد که نمونه گیاهان از سه منطقه استان گلستان جمع آوری شد. نتایج حاصل از شناسایی، سویه های جدا شده را در جنس باسیلوس قرار داد. شش باکتری اندوفیت (هر گیاه دو اندوفیت) جداشد. اندوفیت های جدا شده از نظر پتانسیل ضد قارچی علیه چهار قارچ بنام فوزاریوم اکسی پوروم، آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا و موکور مورد مطالعه قرار گرفتندکه همگی آنها اثر ضد قارچی نشان دادند. در بین آنها اندوفیت های موجود در نعناع فلفلی بیشترین اثرضد قارچی را روی عوامل بیماری زای گیاهی نشان داد. همین طور اثر آنها در رشد گیاه نیز بررسی شد که آزمایشات نتایج قابل قبولی از اثرمثبت آنها در رشد گیاه را نشان داد. کلمات کلیدی: گیاهان دارویی،اندوفیت، آنتاگونیسمی، باسیلوس عنوان صفحه چکیده 1 مقدمه 2 اهمیت و ضرورت تحقیق 3 اهداف تحقیق 3 فصل اول- کلیات   1-1-اندوفیت................................................................................................................................................ 4 1-1-1- مقدمه.............................................................................................................................................. 4 1-1-2- اکولوژی باکتری های اندوفیت........................................................................................................ 5 1-2-3- منشاء باکتری های اندوفیت............................................................................................................ 5 1-1-4- نحوه ی ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی..................................................... 8 1-1-5- حرکت باکتری های اندوفیت در بافت های گیاهی......................................................................... 10 1-1-6 - محل استقرار باکتری های اندوفیت................................................................................................ 11 1-1-7 - تراکم جمعیت باکتری های اندوفیت.............................................................................................. 12 1-1-7-1- فاکتورهای زنده.......................................................................................................................... 13 1-1-7-1-1- میکروارگانیسم های همراه با گیاه.......................................................................................... 13 1-1-7-1-1-1- باکتری ها و قارچ ها.......................................................................................................... 13 1-1-7-1-1-2- ویروس ها......................................................................................................................... 13 1-1-7-1-1-3- نماتد ها............................................................................................................................. 13 1-1-7-1-2- ژنوتیپ گیاه........................................................................................................................... 14 1-1-7-2- فاکتورهای غیر زنده.................................................................................................................. 14 1-1-8- اثرات مفید باکتری های اندوفیت گیاهی......................................................................................... 15 1-1-8-1- افزایش رشد گیاه........................................................................................................................ 15 1-1-8-2- کنترل بیولوژیکی بیمارگرهای گیاهی.......................................................................................... 17 1-1-8-3- استفاده ازاندوفیت ها در مهندسی ژنتیک.................................................................................... 17 1-1-8-4- افزایش تولید مواد دارویی توسط گیاه........................................................................................ 17 1-1-9- نحوه ی استفاده از باکتری های اندوفیت........................................................................................ 18 1-2- نعناع فلفلی.......................................................................................................................................... 18 1-2-1- ترکیبات........................................................................................................................................... 19 1-2-2- خاستگاه و پراکنش.......................................................................................................................... 19 1-2-3- استفاده های دارویی........................................................................................................................ 19 1-3- مارچوبه............................................................................................................................................... 19 1-3-1- خاستگاه و پراکنش.......................................................................................................................... 20 1-3-2- استفاده های دارویی........................................................................................................................ 20 1-4- بابونه................................................................................................................................................... 20 1-4-1- ترکیبات شیمیایی............................................................................................................................ 20 1-4-2- خواص دارویی و درمانی................................................................................................................ 20 1-5- باسیلوس.............................................................................................................................................. 21 1-5-1- مقدمه.............................................................................................................................................. 21 1-5-2- باسیلوس های خاک و ویژگی آنها.................................................................................................. 24 1-5-3- رنگ آمیزی گرم برای تشخیص باسیلوس ها.................................................................................. 24 1-6- قارچ ها................................................................................................................................................ 24 1-6-1- معرفی کلی ماهیت قارچ ها............................................................................................................ 24 1-6-2- اهمیت بالینی قارچ ها..................................................................................................................... 25 1-6-3- بیماری زایی قارچ ها....................................................................................................................... 26 1-6-3-1- کنترل بیماری های قارچی.......................................................................................................... 26 1-6-4- معرفی قارچ های مورد آزمایش...................................................................................................... 26 1-6-4-1- آسپرژیلوس های بیماری زا........................................................................................................ 26 1-6-4-2- فوزاریوم..................................................................................................................................... 27 1-6-4-3- آلترناریا....................................................................................................................................... 27 1-6-4-4- موکور......................................................................................................................................... 28 فصل دوم : مروری برمطالعات گذشته   فصل سوم : مواد و روش ها   3-1- تجهیزات و دستگاه ها.......................................................................................................................... 33 3-2- انواع و ترکیبات محیط کشت های مورد استفاده................................................................................. 34 3-3- نوع مطالعه و روش نمونه گیری.......................................................................................................... 34 3-4- وسایل نمونه یری............................................................................................................................... 34 3-5- وسایل آزمایشگاهی............................................................................................................................ 34 3-6- انتخاب محیط کشت غربالگری.......................................................................................................... 34 3-7- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی..................................................................... 35 3-7-1- خالص سازی کشت های باکتریایی................................................................................................. 35 3-8- شناسایی مقدماتی جنس و گونه ی جدایه های باکتریایی.................................................................... 34 3-8-1- بررسی توانایی رشد در غلظت های مختلف Nacl........................................................................ 36 3-8-2- بررسی فعالیت آنزیمی..................................................................................................................... 36 3-8-2-1- فعالیت اوره آزی......................................................................................................................... 36 3-8-3- بررسی فعالیت تجزیه ای................................................................................................................. 36 3-8-3-1- تجزیه نشاسته............................................................................................................................. 36 3-9- شناسایی تکمیلی(شناسایی مولکولی با روش ریبوتایپینگ).................................................................. 37 3-9-1- شرایط PCR.................................................................................................................................. 38 3-9-2- تعیین توالی DNA....................................................................................................................... 39 3-10- آزمون بازدارندگی رشد عوامل بیماری زای گیاهی............................................................................ 39 3-10-1- تهیه سوسپانسیون باکتری ها......................................................................................................... 39 3-11- اثر تلقیح باکتری های اندوفیت روی پارامتر رویشی گیاه.................................................................. 40 3-11-1- مرحله کاشت................................................................................................................................ 40 3-11-2- مرحله داشت و تنک کردن........................................................................................................... 41 3-12- اندازه گیری طولی گیاه...................................................................................................................... 41 فصل چهارم : نتایج   4-1- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی..................................................................... 42 4-2- نتایج تست های بیو شیمیایی............................................................................................................... 44 4-3- تعیین توالی محصولات نهایی PCR................................................................................................... 45 4-3-1- نتایج حاصل از سکوئنسینگ ژن 16 s rDNAباکتری................................................................ 45 4-4- نتایج آنتاگونیسمی بدست آمده از سویه های باسیلوس علیه قارچ های مورد آزمایش........................ 58 4-4-1- نتایج اثر ضد قارچی علیه آسپرژیلوس نایجر.................................................................................. 59 4-4-2- نتایج اثر ضد قارچی علیه فوزاریوم اکسیپوروم............................................................................... 60 4-4-3- نتایج اثر ضد فارچی علیه آلترناریا آلترناتا....................................................................................... 62 4-4-4- نتایج اثر ضد قارچی علیه موکور..................................................................................................... 63 4-5- نتایج اندازه گیری رشد طولی گیاه....................................................................................................... 65 4-5-1- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه مارچوبه............................................................................... 66 4-5-2- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه نعناع فلفلی.......................................................................... 67 منابع............................................................................................................................................................... 72 فهرست جداول عنوان صفحه 1-1- راهنمای آسان شناسایی تجربی سویه های شاخص باسیلوس............................................................ 22 3-1- مواد شیمیایی استفاده شده.................................................................................................................. 32 3-2- محیط های مورد نیاز برای انجام تست های بیوشیمیایی.................................................................... 36 3-3- توالی پرایمر طراحی شده برای s rDNA16.................................................................................. 37 3-4- مواد لازم جهت انجام PCR...................................................................................................... 40 3-5- استاندارد های مک فارلند................................................................................................................... 39 4-1- ویژگی های بیوشیمیایی سویه های بدست آمده................................................................................ 43 4-2- نتایج شناسایی مولکولی سویه های باکتریایی جدا شده در سطح جنس و گونه................................. 57 4-3- نتایج آنتاگونیسمی سویه های باسیلوس علیه قارچ ها........................................................................ 58 4-4- نتایج اثر ضد قارچی علیه آسپرژیلوس نایجر..................................................................................... 58 4-5- نتایج اثر ضد قارچی علیه فوزاریوم اکسیپوروم.................................................................................. 60 4-6- نتایج اثر ضد قارچی علیه آلترناریا آلترناتا.......................................................................................... 61 4-7- نتایج اثر ضد قارچی علیه موکور........................................................................................................ 62 4-8- نتایج اندازه گیری رشد طولی گیاه...................................................................................................... 65 فهرست تصاویر عنوان صفحه 4-1- رنگ آمیزی گرم اندوفیت ها............................................................................................................... 42 4-2- کشت اندوفیت ها در محیط کشت api 20E.................................................................................... 43 شکل 4-3 کشت اندوفیت ها در SIM و بررسی حرکت آنها...................................................................... 44 4-4- کشت اندوفیت ها روی Blood agar و بررسی همولیز آنها........................................................... 44 4-5- تعیین توالی نمونه M1- پرایمر Rev................................................................................................ 45 4-6- همولوژی 97% نمونه M1– پرایمر Rev با Bacillus cereus.................................................... 46 4-7- تعیین توالی نمونه M2 - پرایمر Rev............................................................................................. 47 4-8- همولوژی 97% نمونه M2 پرایمرRev با Bacillus thuringiensis............................................ 48 4-9- تعیین توالی نمونه N1 - پرایمر Rev.............................................................................................. 49 4-10- همولوژی 97% نمونه N1– پرایمر Rev با Bacillus thuringiensis..................................... 50 4-11- تعیین توالی نمونه N2- پرایمر Rev.............................................................................................. 51 4-12- همولوژی 97% نمونه N2– پرایمر Rev با Bacillus sp............................................................ 52 4-13- تعیین توالی نمونه B1 - پرایمر Rev........................................................................................... 53 4-14- همولوژی 97% نمونه B1– پرایمر Rev با Bacillus sp............................................................ 54 4-15- تعیین توالی نمونه B2 - پرایمر Rev........................................................................................... 55 4-16- همولوژی 97% نمونه B2– پرایمر Rev با …….…………Bacillus thuringiensis 56 شکل 4-17بازدارندگی رشد جدایه ها علیه قارچ آسپرژیلوس نایجر بر حسب سانتی­متر.......................... 59 شکل4-18اثر بازدارندگی رشد جدایه های مختلف باکتریایی در مقایسه با شاهد روی بیماریگر قارچی آسپرژیلوس نایجر......................................................................................................................................... 59 شکل 4-19بازدارندگی رشد جدایه ها علیه قارچ فوزاریوم اکسیپوروم بر حسب سانتی­متر......................... 60 شکل 4-20 اثر بازدارندگی رشد جدایه های مختلف باکتریایی در مقایسه با شاهد روی بیماریگر قارچی فوزاریوم اکسی پوروم................................................................................................................................... 60 4-21- بازدارندگی رشد جدایه ها علیه قارچ آلترناریا آلترناتا بر حسب سانتی­متر...................................... 64 4-22- اثر بازدارندگی رشد جدایه های مختلف باکتریایی در مقایسه با شاهد روی بیماریگر قارچی آلترناریا آلترناتا............................................................................................................................................. 65 4-23- بازدارندگی رشد جدایه ها علیه قارچ موکور برحسب سانتی­متر..................................................... 66 4-24- اثر بازدارندگی رشد جدایه های مختلف باکتریایی در مقایسه باشاهد روی بیماریگر قارچی موکور 67 4-25 اثر آنتاگونیستی اندوفیت های بومی از مارچوبه ، نعناع فلفلی و بابونه روی قارچ های مختلف......... 67 4-26 اثر تلقیح جدایه های اندوفیت گیاه ماچوبه (M1 و M2 ) روی ارتفاع گیاه مارچوبه....................... 68 4-27 تلقیح و عدم تلقیح در گیاه مارچوبه................................................................................................... 69 4-28 تلقیح و عدم تلقیح در گیاه نعناع فلفلی ............................................................................................ 69 4-29 اثر تلقیح جدایه های N1 و N2 روی رشد گیاه نعناع فلفلی بر حسب سانتی­متر............................. 70 4-30 تلقیح و عدم تلقیح در گیاه بابونه........................................................................................................ 70 4-31اثر تلقیح جدایه های B1 و B2 روی رشد گیاه بابونه بر حسب سانتی­متر....................................... 71 مقدمه حضور و استقرار باکتری های غیر بیماری زا در بافت های گیاهی به سال 1926 و به تئوری پروتی[1] بر می گردد. بعد از سال 1940 تاکنون گزارشات زیادی در ارتباط با باکتری های اندوفیت بومی در بافت های مختلف گیاهی وجود دارد(هالمن و همکاران 1997)[2]. در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند(هالمن و همکاران 1997). از نظر تکاملی به نظر می رسد که باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و آنها ساپروفیت هایی اند که توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند و بدون اینکه میزبان خود را از بین ببرند از مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده نمایند. فسیل ها ارتباط بین گیاهان و اندوفیت ها را نشان می دهند،در نتیجه اندوفیت ها نقش مهم و دراز مدتی را در تکامل حیات بر روی زمین بر عهده داشتند. (هالمن و همکاران 1997). اندوفیت ها درون گیاه حضور دارند و بیش از 120 سال است که شناخته شده اند. بعد ها آنها را به عنوان میکروارگانیسم هایی که می توان آنها را از سطح سترون گیاه جدا نمود شناختند و در علم زراعت نیز این مفهوم بیشتر باکتری هایی را در بر می گیرد که می توانند از سطح سترون بافت جدا شوند و به طور آشکار به گیاه میزبان آسیب نمی رسانند. اغلب این باکتری ها از خاک منشاء می گیرند و باید ابتدا در گیاه کلنیزه شوند که این کلنیزاسیون عمدتا از طریق ترک، زخم، آسیب ریشه صورت می گیرد که به این مناطق اصطلاحا"نقطه داغ[3] می گویند. بعد از کلنیزاسیون و ورود باکتری ها به گیاه به سرعت در فضای بین سلولی در ریشه گسترش یافته و سپس سیستم های ژنتیک اختصاصی بین باکتری و گیاه فعال می شود. اندوفیت ها در گیاه از فرآیندهای سلولی استفاده کرده و از طریق قشر مغز به سایر بافت ها گسترش می یابند که در این فرآیند آنزیم هایی نظیر اندوگلوکانامیس و اندوپلی گالاکتورونیداس را می توان نام برد در این زمان اندوفیت ها می توانند به سرعت در گیاه تکثیر یابند و تعداد خود را افزایش دهند. این باکتری ها قادر به تنظیم سطح اتیلن در گیاه اند و این عمل را ازدو طریق ،شکستن ACC و یا مهار ACC سنتتاز انجام می دهند. همان طور که جانوران و انسان ها به طور معمول با میکرو ارگانیسم های متنوعی در ارتباط اند و میکروارگانیسم ها در توسعه و تحریک سیستم ایمنی نقش مهمی را ایفا می کنند به طور مشابه باکتری های گیاهی یا اندوفیت ها نیز در تحریک واکنش های دفاعی در گیاه نقش دارند و باعث رشد بهتر گیاه از طریق تثبیت نیتروژن، افزایش مواد معدنی در دسترس، تولید 2و3 بوتان دی ال، استوئین که مسئول ارتقاء گیاه اند می شوند. این باکتری ها با تولید مواد ضد میکروبی مانند ترپونوئید، فلاوونوئید، ایزوفلاوونوئید در گیاه باعث مقاومت گیاه در برابر عامل میکروبی بیماری زا در آن می شوند. با توجه به موقعیت جغرافیایی استان گلستان باکتری های بیشماری میتوان از خاک این منطقه جدا نمود که برخی از آنها به صورت اندوفیت می باشند. با توجه به اینکه در مناطق شمالی بیشتر منطقه قابل کشت می باشد و از طرفی این باکتری ها نقش بسیار مهمی را در رشد گیاه و کنترل عوامل بیماری زا در گیاهان ایفا می کنند کمک بسیار بزرگی می تواند در بخش کشاورزی باشد. البته با توجه به اینکه در ایران کمتر به این مسئله پرداخته شده است پس مطالعه روی این موضوع می تواند بسیار حائز اهمیت باشد. اهمیت و ضرورت تحقیق 1. عدم اطلاعات قبلی در زمینه جداسازی و شناسائی باکتری های اندوفیت از گیاهان داروئی در استان 2. بررسی خاصیت ضد میکروبی جدایه های باکتریایی اندوفیت های جدا شده از گیاهان در برابر پاتوژن های قارچی 3. بررسی افزایش توان رشدی در گیاهان حاوی اندوفیت ها در مقابل گیاهان فاقد اندوفیت ها و استفاده از آنها به جای کود های شیمیایی اهداف تحقیق : 1. اندوفیت های 3 گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه جداسازی و شناسائی شدند. 2.اثرات ضد قارچی اندوفیت های جداشده بررسی شدند. 3.توانائی اندوفیت های جدا شده روی افزایش رشد گیاه بررسی شد. فصل اول کلیات 1-1- اندوفیت 1-1-1- مقدمه حضور و استقرار باکتری های غیربیماری زا در بافت های گیاهی به سال 1926 و به تئوری پروتی[4] برمی گردد. بعدازسال 1940 تاکنون گزارشات زیادی درارتباط با باکتری های اندوفیت به عنوان عوامل بیماری زایی خفیف درگیاهان وجود دارد، اما تحقیقات اخیرثابت نمودکه این دسته از باکتری قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده وسبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. باکتری های اندوفیت دراکثر گونه های گیاهی حضور دارند. از نظر تکاملی باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و در واقع ساپروفیتی اند که به سمت بیمارگری تکامل یافته اند و در واقع اندوفیت ها از بیمارگرهای گیاهی تکامل یافته تر بوده و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند، بدون آنکه میزبان خود را از بین ببرنداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خوداستفاده می نمایند(هالمن و همکاران 1997). این میکروارگانیسم هادر قرن نوزدهم شناخته شده اند ولی بررسی قابل توجهی روی آنها صورت نگرفت. اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل یک مرحله از چرخه ی زندگی خود را درون گیاهان سپری می کنند. تعاریف مختلفی برای اندوفیت وجود دارد: کادو[5] عنوان می کند که اندوفیت های باکتریایی در بافت های زنده گیاهی ساکن اند، بدون آنکه به گیاه صدمه ای بزنند. کوئیزیل[6] عنوان می کند که اندوفیت ها قادراند همزیستی داخلی با گیاه برقرار نموده و یک محیط سودمند اکولوژیکی را به واسطه حضور اندونیت ایجاد کنند که گیاه به واسطه ی آن تنش های محیطی را تحمل نموده یا سبب بهبودافزایش رشد گیاه شوند. ویلسون[7] عنوان می کند باکتری های اندوفیت بافت های غیر زنده ی گیاه را مورد تهاجم قرار داده ولی علائمی از بیماری را در گیاه ایجاد نمی کند(هالمن و همکاران 1997). باکتری های اندوفیت باکتری هایی اند با منشا محیط اطراف ریشه (خاک) که حداقل بخشی از چرخه ی زندگی خود را در گیاه به سر می برند و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند بدون آنکه به میزبان خود آسیب بزننداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده می کنند و در تعامل باعث افزایش رشد و تحمل تنش های محیطی برای گیاه می شوند.(پابلو و همکاران 2008)[8]. 1-1-2- اکولوژی باکتری های اندوفیت اندوفیت بودن یک مزیت اکولوژیکی است که بعضی از باکتری ها قادراند بافت های درونی گیاه را کلنیزه نمایند این در حالی است که تعدادی از باکتری ها قادراند گیاه را فقط به صورت اپی فیت کلنیزه نمایند. محیط داخلی گیاه یک محیط حفاظت شده و یکنواختی را برای میکروارگانیسم ها فراهم می کند. عواملی مثل درجه حرارت، اشعه ماوراء بنفش و رقابت های میکروبی از جمله عواملی اند که بقاء طولانی مدت باکتری ها را محدود می سازند. استقرار و بقاء یک جمعیت باکتریایی درون بافت گیاه تحت تاثیر عوامل قرار می گیردکه سلامتی گیاه را نیزتحت تاثیر قرار می دهند(هالمن و همکاران 1997)[9]. تعامل بین گیاه واندوفیت مستلزم آن است که هر دو بتوانند موانع فیزیکی و شیمیایی را که بر سر راه دارند با موفقیت پشت سر نهند تا این ارتباط شکل گیرد(پابلو و همکاران 2008). 1-1-3- منشاء باکتری های اندوفیت بیشترین پرسش هایی که در ارتباط با باکتری های اندوفیتی مطرح است این است که منشا باکتری های اندوفیتی از کجاست و چگونه وارد گیاه می شوند؟(هالمن و همکاران 1997) شروع با این فرض است که اندوفیت ازخاکی که گیاه میزبان در حال رشداست سرچشمه می گیرد و فاکتورهای خاک کلنیزه شدن باکتری در گیاه را مشخص می کند(پابلو و همکاران 2008). در واقع باکتری های اپی فیت، فیلوسفر و ریزوسفر به عنوان منبع باکتری های اندوفیت ذکر شوند. تبادل جمعیتی بین جمعیت های باکتریایی خارج و داخل گیاه از طریق روزنه ها صورت می گیرد. بنابراین باکتری هایی وجود دارندکه قادراند به هر دوصورت اپی فیت و اندوفیت گیاه را کلنیزه کنند(هالمن و همکاران 1997)[10]. فاکتورهایی نظیر ژنوتیپ گیاه، مرحله رشد، وضعیت فیزیولوژیکی، نوع بافت گیاهی، شرایط محیطی (منظورخاک) وشیوه های کشاورزی اغلب تعیین کننده ی کلنیزاسیون اندوفیت ها و جامعه اندوسفری می باشند. علاوه براین موارد صفات ذاتی باکتریایی نیز در کلنیزاسیون و تنوع اندوفیتی نقش مهمی را بازی می کند. به عنوان مثال دیده شده که نسبت باکتری هایی که حرکت سوارمینگ دارند واز داخل ریشه ی گیاه گندم جدا شدندپنج برابر بیشتراز تعداد آنها در ریزوسفر خاک بوده و این نشان می دهد که باکتری هایی که حرکت سوارمینگ داشتند با حرکت خود از طریق کموتاکسی جذب ریشه شده و موفق به تشکیل میکروکلنی شدند(پابلو و همکاران 2008)[11]. در مطالعات میکروسکوپ الکترونی بذر برنج مشاهده شد که جمعیت پایینی از باکتری های اندوفیت در محل های حفاظت شده ای در پوشش بذر، پوسته های بذری، بافت های جنینی حضور دارند، باکتری های اندوفیت این مکان ها را از میان شکاف های ریزی که در پوشش های بذر وجود دارد کلنیزه می کنند. زمان جوانه زنی بذر، باکتری ریشه را کلنیزه نمود و در استیل ریشه بالاترین تمرکز را دارد. در تیمار بذری باباکتری اندوفیت، رادیکال های ریشه که تازه از پوشش بذری خارج شوند کلنیزه می شوند. کلنیزه شدن بافت توسط اندوفیت ها، مهاجرت باکتری ها از میان شکاف های تشکیل شده، در اثر جوانه زنی بذر شروع شده و وارد اندوسپرم می شود وبدین صورت در رادیکال و سایر قسمت های گیاه فراگیر می شود(موخاپودای و همکاران 1996)[12]. ریزوسفرخاک منبع اولیه باکتری های اندوفیت اند. به عبارتی اکثر باکتری های اندوفیت از ریزوسفر منشا گرفته اند و این میکروارگانیسم ها از ریزوسفر به ریزوپلان و سپس به اپیدرم و پوست می آیند. بنابراین ترکیب جمعیت اندوفیت ها بستگی به ترکیب جمعیتی باکتری های مستقر در ریزوسفر گیاه دارد(استورز 1995). استورز[13] باکتری های اندوفیت غده های بذری سیب زمینی سالم را شناسائی نمود و نشان داد، گونه هایی که غده های سالم را به صورت داخلی کلنیزه می نمایند از ریزوسفر گیاه منشا گرفتند، به عبارتی غالب ترین گونه های جدا شده از خاک اطراف ریشه همان گونه هایی بودند که از داخل غده ها جدا شدند(کوادت هالمن و همکاران 1997)[14] 1-1- 4- نحوه ی ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی باکتری های ریزوسفر ابتدا در اثر شیمی گرایی و الکتروتاکسی به صورت تصادفی به میزبان نزدیک می شوند. نحوه ی ورود باکتری های اندوفیت به درون بذر از طریق سیستم آوندی، لوله تندشی دانه گرده وشکاف های موجود در پوشش بذر صور ت می گیرد(هالمن و همکاران 1997)[15]. به عبارتی دیگر ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی از طریق روزنه، عدسک، زخم های حاصله از شکسته شدن تریکوم ها، منطقه ی خروج ریشه های جانبی و منطقه ی خروج رادیکال های ریشه صورت می گیرد(پابلو و همکاران 2008)[16]. باکتری هایی که قادراند در گیاه به صورت اندوفیت درآیند، ابتدا سطح ریشه را کلنیزه نموده و در نهایت بافت های درونی گیاه را کلنیزه می نمایند، به طوری که ابتدا در اثر شیمی گرایی و الکتروتاکسی، به صورت تصادفی به میزبان نزدیک می شوند. دراین رابطه یو و همکارانش[17] اتصال گونه ی آلکالیژنزفکالیس[18] را در سلول های ریشه ی برنج مطالعه نمودند. این باکتری ریزوسفر را کلنیزه نموده و در نهایت تعدادی از سلول های آن قادر بودند به سلول های ریشه واردشوند. این باکتری دارای تاژک است که توسط آن به سمت ترشحات ریشه که اسیدآمینه، قند و اسیدهای ارگانیک بوده حرکت می نمایند. روند اتصال در سه مرحله صورت می گیرد: 1)اتصال(جذب)[19] : این مرحله به اتصال سلول های باکتری به سطح سلول های ریشه را گویند. دراین حالت تعامل بین ریشه و باکتری ضعیف است و پروتئین های سطحی موجود در دیواره سلولی باکتری در آن نقش دارد. 2)مهار[20]: اتصال بسیار قوی سلول های باکتری به سطح سلول های ریشه را گویند و روی ریشه تثبیت می شوند. در این حالت تعامل بین باکتری و میزبان بسیار قوی می شود 3)کلنیزاسیون[21]: پراکنش، رشد و تکثیر باکتری های ثبت شده در لایه ی موسیژل ریشه را گویند. در این مرحله حتی با تکان دادن شدید هم از سطح ریشه جدا نمی شوند. مکان های موثر در اتصال باکتری به ریشه، محل های تخلیه ی پروتون در سطح ریشه است که در این مکان ها ATpas فعالیت می نماید. شیب های بیولوژیکی و فیزیکی که نتیجه خروج فعال و غیرفعال مواد غذایی از ریشه می باشد از مکان های موثر در اتصال باکتری ها می باشد(بتینا 1983)[22]. ورود باکتری های اندوفیت به درون گیاه بیشتر از میان زخم هایی است که به طور طبیعی در گیاه ایجاد شده است برای مثال زخم حاصل از رشد گیاه در محل تارهای کشنده و اتصالات اپیدرمی نمونه ای از راه های ورود باکتری های اندوفیت می باشد. باکتری های اندوفیت از راه بافت های مریستمی ریشه وارد گیاه می شوند. ریشه های ثانویه در محل انشعاب به طور وسیعی کلنیزه می شوند. در اثر انشعابات ایجاد شده در ریشه ناحیه اندودرمسیی پوست شکاف یافته که منجر به کلنیزه نمودن باکتری در منطقه مذکور می گردد. در نهایت باکتری در عرض اندودرم گسترش یافته و به بافت های آوندی نفوذ می کنند. پیچ خوردگی های دیواره ی سلولی، تارهای کشنده ریشه، محل اتصال بین تارهای کشنده ی ریشه وسلول های اپیدرمی ازمحل های ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی می باشند(ای گوروس، هالمن و همکاران)[23]. در مواردی زخم های گیاهی توسط بعضی از میکروارگانیسم ها و عوامل زنده ی خاک مانند قارچ ها، نماتدهای پارازیت گیاهی، حشرات و عواملی مانند نوسانات شدید حرارتی ایجاد می شود. زخم های ایجادشده ضمن اینکه راه را برای نفوذ باکتری های اندونیت باز می نمایند باعث تراوش ترشحات گیاهی به بیرون می شود و منبع غذایی مناسبی را جهت تکثیر باکتری ها ایجاد می نماید)پابلو و همکاران 2008([24]. در برخی موارد رخنه یا نفوذ باکتری به درون بافت گیاهی از طریق فعالیت آنزیمی صورت می گیرد. آنزیم هایی وجود دارندکه سبب دژنره شدن پیوندهای پلی ساکاریدی دیواره سلولی می شوند. هیورک و همکاران اش[25] نشان دادندآنزیم سلولایتیک در باکتری آزادورئوس[26] باعث نفوذ فعال باکتری درسلول های ریشه گیاه می شود(هورک و همکاران1994)[27]. کوادت و همکارانش[28] نشان دادند آنزیم سلولاز در انتروباکتر اسپوریا[29] و سودوموناس فلوئورنس[30] سبب تجزیه ی سلولز می شود(کودات هالمن و همکاران 1997)[31]. بل و همکارانش[32] مشاهده نمودند فراوانی آنزیم هیدرولیتیک در باکتری های ریزوسفر ریشه بیشتر از باکتری های ساکن درآوندهای چوبی است.(بل و همکاران)[33]. باکتری های اندوفیت دارای مکانیزم تنظیمی برای تولید آنزیم های دژنره کننده ی دیواره ی سلولی در زمان های خاصی می باشند. این اطلاعات نشان می دهد که این دسته از باکتری ها تولید سلولاز و پکتیناز را فقط برای نفوذ فعال درون بافت گیاه تولید می کنند. به عبارتی این آنزیم فقط در زمان شروع اولین مرحله تهاجم باکتری صورت گرفته و بعداز قرار گرفتن باکتری در درون بافت گیاه متوقف می شود. 1-1-5- حرکت باکتری های اندوفیت در بافت های گیاهی اندوفیت های گیاهی به دوصورت در گیاه کلنیزه می شوند: 1) تنها بافت را کلنیزه می کنند و در واقع محدود به بافت های گیاهی می شوند. 2) کلنیزه نمودن سیستمیک و فراگیر گیاه. دراین نوع کلنیزاسیون باکتری از میان آوندهای مسیرهای درون سلولی و بین سلولی و آپوپلاستی عبور می کند و بستگی به گونه ی باکتری دارد. کوادت و همکارانش[34] مشاهده نمودند زمانی که بذر پنبه را با سودوموناس فلوئورنس[35] تلقیح می کنند این باکتری بافت آوندی را کلنیزه نمی کند و وارد برگ و ساقه نمی شود. ولی زمانیکه بذر پنبه را با انتروباکتراسپوریا[36] تلقیح می کند این باکتری وارد ساقه، دمبرگ و مریستم بالایی گیاه می شود در اینجا چند فرضیه مطرح می شود: فرضیه اول: محدودیت در گسترش سیستمیک باکتری سودوموناس فلوئورنسس به علت شناسائی باکتری توسط میزبان است که منجربه واکنشی فعال دفاعی گیاه می شود. فرضیه دوم: الگوهای افتراقی جهت کلنیزه نمودن بافت های داخلی گیاه توسط اندوفیت ها وجود دارد. به طوری که ممکن است بعضی از اندوفیت ها اختصاصا پوست را کلنیزه نمایند و بعضی دیگر از کلنیزه کنندگان سیستمیک گیاه باشند(بل و همکاران1995)[37]. 1-1-6 - محل استقرار باکتری های اندوفیت به طور کلی باکتری های اندوفیت فضای بین سلولی را کلنیزه می کنند ولی تعداد محدودی از باکتری ها قادر به کلنیزه نمودن داخل سلولی می باشند. باکتریazoarcus.spیکی از اندوفیت های تثبیت کننده ی ازت است که قادر است هم داخل سلول وهم در فضای بین سلولی تکثیر یابد. بدین صورت که پس از تکثیرنمودن در فضای بین سلولی واردسلول های دایره محیطیه شده و سپس وارد سلول های پارانشیم می شود. در ارتباط با کلنیزه نمودن بافت های آوندی توسط باکتری ها این سوال مطرح است که آیا بافت آوندی به صورت کانال انتقال برای حرکت اندوفیت ها عمل می کند؟ یا اینکه باکتری درون سیستم آوندی تکثیر می شود. در صورتیکه تکثیر باکتری مطرح باشد می بایست جمعیت بالایی از باکتری ها در درون آوندهای گیاهی باعث بسته شدن سیستم آوندی شده و سبب ایجاد بیماری در گیاه شوند. با توجه به اینکه جمعیت باکتری های اندوفیت درون سیستم آوندی به نسبت پایین تراست، بنابر این کلنیزه نمودن کمتر بافت آوندی توسط اندوفیت های مفید باعث می شود تا فضای کمتری از آوندهااشغال شود که این یک خصوصیت مهم برای اندوفیت ها و یک عامل اصلی در تمایز اندوفیت های مفید از بیمارگرهای گیاهی می باشد(کودات هالمن و همکاران)[38]. چن و همکارانش[39] ثابت نمودند که اندوفیت ها با تکثیر در بافت گیاه تراکم جمعیتی خود را به سطح معینی می رسانند و آن را درسطح معینی نگاه می دارند. نتایج بدست آمده نشان داد که تغییرات جمعیتی اندوفیت ها در گیاه به سن گیاه و فاکتورهای گیاهی بستگی دارد و باافزایش سن گیاه میزان تراکم جمعیتی آنها در بافت گیاهی کاهش می یابد. باکتری های گیاهی اندوفیت برای رشد و استقرار در بافت گیاهی به مواد غذایی نیاز دارند و از مواد موجود در فضای بین سلولی استفاده نموده و می توانند از مواد دیواره ی سلولی به عنوان منبع غذایی استفاده کنند)هالمن و همکاران1997)[40]. کنی و هوانگ[41] نشان دادند در فضاهای بین سلولی پتاسیم، کلسیم و مقادیر کمی گوگرد، فسفر و کلر وجود دارد که مورد استفاده اندوفیت ها قرار می گیرد. از آن جائیکه غلظت یو ن های معدنی در فضای بین سلولی متغیر می باشد لذا این موضوع می تواند برای پراکنش ناهمگن اندوفیت ها در بافت های گیاهی توجیه مناسبی باشد)چن و همکاران1995). 1-1-2 تراکم جمعیتی باکتری های اندوفیت جمعیت های باکتری های اندوفیت موجود در گیاه همواره در حال تغییر می باشد و از آن جائیکه باکتری ها در بافت های گیاهی پراکنش ناهمگن دارند برآورد درستی از جمعیت اندوفیت ها صورت نگرفته است. تفاوت هائی نیز در فراوانی جنس های مختلف باکتری ها در بافت های مختلف گیاهی وجود دارد. عموما تنوع گونه های باکتریایی در ریشه بیشتر از ساقه است.برای مثال چهارده گروه باکتریایی در ریشه ی پنبه شناسائی شدند که در ساقه وجود نداشتند بیشترین آنها اگروباکتریوم تیومفاشنس[42]، بورخولدریاسولاناسروم[43] و سراشیا[44] بودند و فقط چند گونه باسیلوس از ساقه جدا شدند(بتینا.و1983)[45]. اندوفیت ها به سه صورت در گیاه ظاهر می شوند: گاهی اوقات به آنها اندوفیت های گذرا می گویندکه اغلب محدود به بافت قشر ریشه اند و در برخی موارد به صورت فرصت طلب اند که این نوع ابتدا در ریزوسفر کلنیزه می شوند و سپس به داخل بافت می روند و در حالت سوم به صورت اندوفیت کامل اند)پابلو و همکاران2008).[46] از لحاظ تراکم جمعیتی ریشه بالاترین جمعیت باکتریایی را دارد و جمعیت باکتریایی در ساقه پایین تر از ریشه ها بوده و در دمبرگ جمعیت آنها به پایین ترین میزان می رسد(لامب و همکاران1996)[47]. تغییر و تنوع ساختار جمعیتی اندوفیت ها در بافت های گیاهی ارتباط زیادی به فاکتورهای زنده و غیر زنده دارد که با هم در تعامل می باشند 1-1-7-1- فاکتورهای زنده 1-1-7-1-1- میکروارگانیسم های همراه باگیاه میکروارگانیسم های همراه با گیاه شامل باکتری ها و قارچ ها ویروس ها و نماتد ها می باشد. 1-1-7-1-1-1- باکتری ها و قارچ ها باکتری های اندوفیت با باکتری ها وقارچ های کلنیزه کننده بافت های گیاهی در تعادل می باشند. فضا و موادغذایی فراهم شده توسط گیاه از عوامل محدود کننده برای اندوفیت ها و دیگر ارگانیسم ها می باشد. تعاملاتی بین میکروارگانیسم ها وجود دارد که جمعیت اندوفیت ها را تحت تاثیر قرارمی دهداین تعاملات شامل آنتی بیوز، محدودیت مکان های اکولوژیکی و همزیستی می باشند. برای مثال کوادت و همکارانش درآزمایشی نشان دادند زمانی که در باکتری اندوفیت انتروباکتر اسپوریا و باسیلوس مارسسنس[48] با هم تیمار بذری بکار برده شوند، کاهش اندازه جمعیتی هر دواندوفیت در مقایسه با زمانی که هر کدام ازاندوفیت ها به تنهایی بکار برده شوند. در ریشه های گیاه مشاهده شده است . در این مورد کاهش اندازه جمعیت، به خاطر رقابت برای منابع محدود غذایی و فضای فیزیکی محدود درون بافت گیاه می باشد. 1-1-7-1-1-2- ویروس ها تعامل اندوفیت و ویروس ها بسیار جزئی است که احتمالا ًبه خاطر زیستگاه متفاوتی است که این دو گروه دارند. معمولا ًباکتری ها فضاهای بین سلولی ریشه ها و قسمت های پایینی گیاه را کلنیزه می نمایند در صورتیکه ویروس ها درون سلولی بوده و قسمت های هوایی گیاه را مورد تهاجم قرار می دهند ولی به طور کلی ویروس وباکتری وابسته به متابولسیم فعال گیاه بوده و برای دریافت انرژی تولید شده توسط گیاه باهم رقابت می کنند(هالمن و همکاران1997)[49]. 1-1-7-1-1-3- نماتدها وجود نماتدهای پارازیت گیاهی نیز باعث افزایش جمعیت باکتری های درون گیاه می شود، زخم ایجاد شده توسط نماتد راه را برای ورود باکتری ها فراهم می سازد و نشت مواد غذایی باعث به وجود آمدن جمعیت بالایی از باکتری ها شده و باعث تقویت کلنیزه کنندگانی که منشاءآنها ریزوسفر می باشند می شود(هالمن و همکاران1997). 1-1-7-1-2- ژنوتیپ گیاه استفاده وسیع ازارقام مقاوم علیه پاتوژن های باکتریایی این سوال را مطرح می کندکه آیا ژنوتیپ گیاه جمعیت باکتری های اندوفیت را تحت تاثیر قرار می دهد؟ صفات ویژه ای در گیاه شناخته شده که قادرند جمعیت های میکروبی ریزوسفر و اندوفیت را تغییر دهند به عنوان مثال تغییرات فیزیولوژی گیاه می تواند باعث افزایش جمعیت باکتری های اندوفیت شود. گیاه باید خصوصیات فنوتیپی مشخصی جهت ورودباکتری ها به درون ریشه داشته باشد. لذا ارقام زراعی اصلاح شده ممکن است دارای مورفولوژی و یا ترکیب شیمیایی خاصی باشند که توانایی باکتری های ریزوسفر را برای کلنیزه نمودن درون گیاه تحت تاثیر قرار دهند. گونه هایی که ریزوسفر را کلنیزه می کنند و بعدازآن بافت های درونی گیاه را کلنیزه نمایند باعث تغییراتی در فیزیولوژی گیاه می شوند(هالمن و همکاران1997). لذا نوع گیاه می تواند به عنوان یکی از عوامل اصلی تاثیر گذار در ساختار جمعیتی باکتری ها باشد وازآن جائیکه اندوفیت ها به موادغذایی فراهم شده بوسیله ی گیاه وابسته اند هر گونه وپارامتری که وضعیت تغذیه ای گیاه را تحت تاثیر قرار دهد قادر خواهد بود جمعیت باکتری های اندوفیت را نیز تحت تاثیر قرار دهد. بنابراین مقاومت گیاه در مقابل بیمارگرضمن اینکه به ژنتیک گیاه وابسته است می تواندبه علت مقاومت القا شده در گیاه بواسطه تغییر در جمعیت اندوفیتی باشد که با مقاومت گیاهی همراه است(سیسیلیوانا و همکاران1998)[50] بیرا عنوان می کند که ممکن است مقاومت گیاه به بیمارگر تنها به خاطر سیستم ژنتیکی گیاه نباشد بلکه احتمال دارد مقاومت ایجاد شده در گیاه به خاطر تغییر در جمعیت اندوفیتی گیاه باشد که یک مقاومت چند جانبه را در گیاه ایجاد نموده است(برد1982)[51]. 1-1-7-2- فاکتورهای غیرزنده بافت درونی گیاه، محیط حفاظت شده ای رابرای باکتری های اندوفیت فراهم می کند. عواملی از قبیل درجه حرارت شرایط خاک واشعه ی ماورای بنفش به صورت مستقیم روی گیاه میزبان و به صورت غیر مستقیم روی باکتری های اندوفیت اثر می گذارند. فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی خاک مانند درجه اسیدیته، شوری و بافت خاک جمعیت اندوفیت ها را با تغییر در جمعیت باکتری ها ی ریزوسفری به صورت غیر مستقیم تحت تاثیر قرار می دهد(کوادت هالمن و کلوپر)[52]. ماهانی نشان داد که کلنیزه شدن ریشه لوبیا با باکتری در خاک شنی در مقایسه باخاکی که شن کمتری دارد بیشتر بوده است واین به خاطر زخم های ایجاد شده به هنگام رشد ریشه در میان کریستال های ریز شنی می باشد(ماهافی و همکاران1997)[53]. 1-1-8- اثرات مفید باکتری های اندوفیت گیاهی 1-1-8-1- افزایش رشد گیاه باکتری های اندوفیت سبب افزایش رشد محصولات می شوند.استورز[54] نقش اندوفیت های باکتریایی شبدر وسیب زمینی را در افزایش رشد سیب زمینی آزمایش نمود. در این مطالعه مشخص شد 21 درصد از جدایه ها باعث افزایش رشد گیاه می شوند. این جدایه ها به میزان 63 درصد باعث افزایش ارتفاع اندام های هوایی گیاه و به میزان 66 درصد باعث افزایش وزن اندام های هوایی و به میزان 55 درصد باعث افزایش وزن ریشه ها شدند. 24 درصد از جدایه ها نیز باعث کاهش رشد و 56 درصد نیز اثری روی رشد گیاه نداشتند. در آزمایش دیگری زمانی که دو جدایه اندوفیت هابه نام کورتوباکتریوم سیتروم[55] و ریزوبیوم لگومینوساروم[56] همزمان روی شبدر تلقیح شدند باعث افزایش رشد گیاه شده و هنگامی که هر کدام به تنهایی تلقیح شوند باعث کم شدن رشد شبدر شده بودند این موارد طبیعت رقابتی بودن اندوفیت ها را نشان می دهد و زمانی که در اثر این رقابت رشد گیاه افزایش می یابد، اثرات آلوپاتیک سودمند اندوفیت های باکتریایی توجیه می شود. به عبارتی دیگر در اثر رقابت اندوفیت های باکتریایی در گیاه و اثرات بیوشیمیایی آنها بر یکدیگر، بیومولکول هایی ازمحیط شان آزاد شده که سبب افزایش رشد گیاه می شود(استورز و همکاران1998). گاهی افزایش رشد گیاه بخاطر افزایش مواد معدنی و بهبود روابط آبی در گیاه می باشد که با کلنیزه شدن ریشه های گیاه توسط اندوفیت های باکتریایی همراه است. (استورز و همکاران1998). تعدادی از اندوفیت ها با تولید هورمون یا تنظیم کننده های رشد مانند اتیلن، اکسین، سیتوکینین و جیبرلین باعث افزایش رشد گیاه می شوند. از آنجائی که این تنظیم کننده ها در غلظت های پایین باعث افزایش رشد گیاه می شوند حتی مقادیر کلی از افزایش غلظت هورمون میتواند اثرات مخربی را روی رشد یا مورفولوژی گیاه ایجاد نماید. برای مثال تولید هورمون اندول استیک اسید در باکتری هایی که اثرات مخربی روی گیاه دارند هفت برابر بیشتر از باکتری هایی است که اثرات مفیدی روی رشد گیاه دارند لذا باافزایش تولید هورمون در این دسته ازباکتری های مضر، اثرات نامطلوبی روی رشد و مورفولوژی گیاه خواهند داشت)لوپر و همکاران1986)[57]. باکتری های اندوفیت قادر به تنظیم سطح اتیلن در گیاهان هستند. فیتوهورمون اتیلن نقش محوری در متابولیسم سلول گیاهی دارد. Acc دآمیناز از سیتوپلاسم باکتری دفع می شود و Acc را به آمونیاک و آلفاکتوبوتیرات می شکند و در نتیجه باعث افزایش رشد گیاهی در شرایط استرس محیطی می شود که میتواند مثبت یا منفی باشد. اندوفیت ها از دو طریق در تنظیم Accسطح اتیلن نقش دارند: یا از طریق شکستن Acc و یا از طریق مهار Acc سنتاز. باکتری از طریق تنظیم دآمیناز و کاهش تولید اتیلن توسط گیاه مقاومت آن را به تنش، شوری، افزایش می دهد. یکی از دلایل کاهش یا عدم رشد گیاه در شرایط تنش های غیر زنده مثل شوری، تجمع اتیلن است در این شرایط مقدار Acc در داخل گیاه افزایش می یابد که پیامدآن افزایش سطح اتیلن در بافت های گیاهی می باشد. اگر چه اتیلن در رشد و توسعه گیاه و رسیدگی میوه اهمیت زیادی دارد بااین حال افزایش غلظت اتیلن درون گیاه می تواند باعث کاهش جوانه زنی و رشد ریشه گردد. در مدل های ارائه شده پیشنهادشده که باکتری های اندوفیت با توانایی تولید آنزیم Accدآمیناز می توانند میزان اتیلن را در گیاه کاهش دهند و در نتیجه اثرات ضد شوری را تعدیل نمایند. در این مدل باکتری های اندوفیت به سطح بذر چسبیده و در پاسخ به تریپتوفان و دیگر اسیدآمینه های ترشح شده توسط بذر، اندول استیک اسید سنتز می نمایند. اندول استیک اسید[58] توسط بذر جذب شده و باعث تحریک رشد سلول های گیاهی و تحریک Acc سنتتاز می شود. Acc تولید شده در این واکنش از بذر جوانه زده و به خارج ترشح می شود و توسط آنزیم Acc دآمیناز باکتری به آمونیاک و آلفاکتوبوتیرات هیدرولیز می شود. هیدرولیز Acc توسط باکتری های مستقر در خارج گیاه موجب کاهش Acc موجود در ریزوسفر می گردد. بنابر این برای حفظ تعادل میزان Acc در خارج و داخل گیاه بایستی مقداری از این ماده رابه خارج ترشح نماید که با این عمل مقدار اتیلن در داخل گیاه کاهش می یابد و متعاقباً طویل سازی ریشه صورت می گیرد)پابلو و همکاران2008)[59]. 1-1-8-2- کنترل بیولوژیکی بیمارگرهای گیاهی باکتری های اندوفیت همان نیچ اکولوژیکی راکه باکتری های بیمارگرآوندی مورد حمله قرار می دهند، کلنیزه می نمایند. در کنترل بیولوژیکی بیمارگرها، بکارگیری نیچ دیگری جهت استقرار عوامل بیوکنترل، سبب کنترل بیماری و پایداری عامل بیوکنترل میشود (دونگ وهمکاران1994)[60]. مکانیسم بیوکنترل به صورت تولید ترکیبات ضدقارچی، تولید سیدروفور، رقابت برای مواد غذایی، محدود شدن نیچ اکولوژیکی و مقاومت القایی گیاه می باشد. در مواردی ممکن است دو یا چند مکانیسم باهم در کنترل بیولوژیکی عمل نماید. باکتری های اندوفیت با تولید مواد ضد میکروبی مانند ترپونوئید، فلاوونوئید، ایزوفلاوونوئید در گیاه باعث محافظت آنها از فیتوپاتوژن ها وجانورانی مانند نماتدها یا گیاهخواران می شوند(پابلو و همکاران2008). 1-1-8-3- استفاده از باکتری های اندوفیت در مهندسی ژنتیک جدیدترین تحقیقات در ارتباط با استفاده از باکتری های اندوفیت در مهندسی ژنتیک است. باکتری کلاوی باکتر[61] درون آوندهای چوبی قرار دارد و به طور طبیعی درمرغ باعث ایجاد بیماری می شود. این باکتری که به لحاظ ژنتیکی دستکاری شده قادراست گیاه را به صورت فراگیر کلنیزه نماید. تومانسیو[62] از این باکتری جهت بیان ژن مولد اندوتوکسین پروتئینی باکتری باسیلوس تورنجنسیس[63] برای مبارزه با آفت کرم ساقه خوار ذرت استفاده نمود. گونه هایی از این اندوفیت را که قادر به بیان ژن مولد اندوتوکسین پروتئینی بودند وارد گیاهچه ذرت نمودند. این اندوفیت هابا ورود به آوندهای چوبی، گیاه را به طور سیستمیک کلنیزه نموده و باعث آزادسازی اندوتوکسین در گیاه شدند. این توکسین در گیاه به صورت فراگیر در آمده و در اثر تغذیه آفت از بافت های گیاه به خصوص قسمت های آوندی باعث کنترل آفت می شود)توماسینو و همکاران1995). 1-1-8-4- افزایش تولید مواد دارویی توسط گیاه داروهای مثل تاکسول، وینکریستین، اتوپوساید، توپرتکان، وینربلاستین چند نمونه از داروهای مشتق شده ی گیاهی برای درمان سرطان می باشند که درحال حاضر برای درمان چهار نوع سرطان در انسان استفاده می شوند. یکی از مشکلات مهم استفاده از این مقدار کم این مواد توسط گیاهان می باشد. به طوریکه تخمین زده شده برای هزارودویست بیمار نیاز به بیست وپنج کیلو از تاکسول می باشد که برای تولید این مقدار نیاز به سی و هشت هزار درخت سرخدار می باشد. در دهه ی گذشته قارچ های اندوفیت جداشده از بافت گیاهی تولید کننده ی این دارو شناسایی شد. دانستن ارتباط بین اندوفیت ها در گیاهان ضرورت دارد و واقعیت این است که ترکیب فاکتورهای گیاهی واندوفیتی باعث افزایش تجمع این متابولیت های ثانویه می گردد و از این رومی توان روش مطمئن واقتصادی وبی خطر برای محیط زیست را برای تولید این مواد جایگزین کرد(پابلو و همکاران 2008)[64]. 1-1-9- نحوه ی استفاده از باکتری های اندوفیت برای استفاده از باکتری های اندوفیت در تولید محصولات کشاورزی، روش های عملی و واقعی باید توسعه یابد.به طور عمومی، روش های توسعه یافته ای برای استفاده از این دسته از باکتری ها در ریزوسفر و سطح اندام های گیاه وجود دارد. تیمار بذری (خیساندن بذر در سوسپانسیون باکتری یا تزریق سوسپانسیون باکتری به داخل بذر)، خیساندن خاک، تزریق به درون ساقه و اسپری سوسپانسیون باکتری روی سطح اندام ها ی گیاه، وارد نمودن از طریق ایجاد زخم، مایه زنی در شرایط خلاء و فرو بردن ریشه های هرس شده به داخل سوسپانسیون باکتری از روش هایی اندکه برای واردنمودن آنها به داخل گیاه در سطح آزمایشگاهی استفاده می شوند. در مجموع تیمار بذر با باکتری یک روش معتبر، آسان، ارزان، سریع واقتصادی می باشد. با وجوداین، تلفیقی از روش های تیمار بذر با خیساندن خاک یا اسپری نمودن سطح اندام های گیاه می تواند کلنیزه نمودن باکتری را در داخل گیاه افزایش داده و باعث تداوم تاثیرات سودمند آنها روی گیاه گردد. با این حال دانش ما در ارتباط با چگونگی ورود و کلنیزه نمودن گیاه محدود است و توسعه تکنولوژی ها برای کاربرد موفق آنها، بستگی به افزایش دانش و فهم ما از اکولوژی این دسته از باکتری ها دارد(هالمن و همکاران1997)[65]. 1-2- نعناع فلفلی نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaو با نام عمومی peppermintیک گیاه علفی چند ساله است که در رده بندی گیاهی از تیرهlamiaceae راسته ی lamialse و ردهی Rosidae می باشد. برگ های آن بیضوی، متقابل، نوک تیز، دندانه دار، کمی پوشیده از کرک به در ازای 7-4 سانتی متر و به عرض 3-2 سانتی متر است. گل ها نامنظم، کامل، اکثرا دوجنس و مجتمع به صورت گروهی در روی ساقه و در انتهای ساقه ظاهر می شوند. 1-2-1- ترکیبات 25 درصد برگ خشک نعناع حاوی حدود 50 درصد منتول ، 30-10 درصد منتون و 10 درصد به بالا استرهای منتیل و مشتقات منوترپن تشکیل شده است. 1-2-2- خاستگاه و پراکنش نعناع فلفلی گیاهان تیره نعناع طوری در کره ی زمین پراکنده شده اند که دراغلب نواحی یافت می شوند. ولی بیشینه انتشار آنها در منطقه ی مدیترانه است. امروزه در کشورهای مختلف جهان، متجاوز از یک هزار تن اسانس در سال، ازاین گیاهان تهیه می شود و این خود درجه اهمیت و توسعه کشت آنها را در نقاط مختلف کره ی زمین نشان می دهد. درمورد منشاء این گیاه اختلاف نظرهایی وجود دارد. عده ای از گیاه شناسان منشاء نعناع را آسیا می دانند. در حالیکه عده ای دیگر از محققان منشاءآن را انگلیس می دانند. 1-2-3- استفاده های دارویی درحال حاضر در ایران از اسانس نعناع در ساخت داروهای گیاهی زیر که در کشورمان به ثبت رسیده است استفاده می شود. برای مثال فرض قرص مکیدنی آلتادین(مواردمصرف:التهاب های مخاط گلوودهان)، قرص های روکش دارالیکوم(مواردمصرف:پایین آورنده ی فشار و چربی خون، ضد تصلب شرائین،ضدنفخ،اشتهاآور)، گرانول پلانتاژل(موارد مصرف:اسهال های ساده)، قرص درگلیس(موارد مصرف:درمان زخم معده، زخم اثنی عشر، گاستریت و نفخ معده)، پودر کارامین(موارد مصرف:اختلالات هضم همراه نفخ)، شربت کاراوی میکسچر(موارد مصرف:دل درد نوزادان و اختلالات گوارشیدر کودکان)، قرص مکیدنی ماسومنت موارد مصرف:التهاب گلو در سرماخوردگی و سرفه) اسانس نعناع در صنایع غذایی، بهداشتی و آرایشی، شیرینی پذیری، نوشابه سازی و تولید ادویه مورد استفاده قرار می گیرد. در اهواز کنار بسته های خرما شاخه ای از نعناع قرارمی دهند که از کرم زدگی آن جلوگیری نماید. 1-3- مارچوبه مارچوبه گیاهی علفی ، چند ساله، دو پایه است و گل های بسیار کوچک آن در روی پایه های نر و ماده قرار دارند. مارچوبه دارای دو نوع ریشه است یکی ریشه های معمولی که جذب آب و مواد غذایی را به عهده دارند و دیگری ریشه های متورم که پر از ذخایر موادغذایی هستند. مارچوبه دارای دو نوع ساقه است اول ساقه های هوایی نازک به رنگ سبز و دیگری ساقه های جوان هستند. 1-3-1- خاستگاه و پراکنش مارچوبه مارچوبه به صورت وحشی دراکثر نقاط دنیا می رود منشاءآن منطقه ی مدیترانه ای شرقی است و از آنجا به تمام نقاط جهان راه یافته است. 1-3-2- استفاده های دارویی از نظر طب قدیم ایران، مارچوبه گرم و خشک است مارچوبه سرشار از منیزیم، نیاسین، فسفر، پتاسیم ، ریبوفلاوین سلینوم، تیامین، روی، فیبر و ویتامین های A.B.C.E می باشد. این گیاه منبع بسیارخوبی ازفولات است. ازاین گیاه برای رفع خواب آلودگی صبحگاهی، کاهش وزن تقویت کننده ی قلب استفاده می شود. همین طوربه علت داشتن کلروفیل خون ساز است و کسانی که کم خونی دارند از آن استفاده می کنند و به ساخت گلبول های قرمز خون کمک می کند(پولا گاردینر2000)[66] 1-4- بابونه گیاهی است یک ساله، معطر به ارتفاع 40-20 سانتی متر که به صورت خودرو در مزارع می روید. ساقه ی آن دارای انشعاباتی است و برگ های آن بریدگی ها ی باریک و دراز با ظاهر برگچه مانند دارد. ساقه ی آن به رنگ سبز مایل به سفید و برگ های آن کوچک متناوب و پوشیده از کرک است. 1-4-1- ترکیبات شیمیایی بابونه از ترپونوئیدها، فلاوونوئیدها، کومارینس، اسپیرودرما، کولین، تانن و پلی ساکاریدها تشکیل شده است. 1-4-2- خواص دارویی و درمانی مقوی معده، اشتهاآور، هضم کننده ی غذا، صفرا بر، التیام دهنده است. اثرضد عفونی کننده ضعیف ولی قاطع دارد. مسکن درد و ضد تشنج نیز می باشد. چون از ترشح و التهاب های چرکین مخاط جلوگیری به عمل می آورد از این نظر به کار بردن آن در رفع یبوست اثر مفید دارد. از بابونه در موارد سوء هاضمه، آبریزش بینی، آسم، درمان قلنج، میگرن، انسداد کبدی و ورم پلک ها استفاده می شود. بابونه عامل موثری در تحریک گلبول های سفید خون و افزایش آنها است و باعث تقویت سیستم دفاعی بدن در برابر بیماری ها می شود. بابونه به دلیل وجود کامازولن دارای خاصیت ضد آلرژی است. فلاوونوئیدهای گل بابونه اثر مطلوب لطیف کنندگی دارند و از این رو مواد مذکور در صنایع آرایشی و بهداشتی استفاده می شود. تولید حوله های مرطوب بهداشتی برای مداوای تورم اطراف چشم، کرم محافظ پوست بدن به عنوان پیشگیری کننده از آسیب رسیدن به پوست های خشک و حساس وهم چنین پوست هایی که به آسانی ترک می خورند(پوالا گاردینر1999)[67]. 1-5- باسیلوس 1-5-1- مقدمه بیشترین باکتری های اندوفیت جداشده از بافت های سالم گیاهی مربوط به جنس های سودوموناس، باسیلوس، انتروباکتر، اگروموباکتریوم می باشد(پترسون و همکاران1981)[68]. دراین میان استفاده از گونه های مختلف باسیلوس به دلیل ویژگی حضور گسترده در محیط، تحمل دمای بالا و فرم مقاوم به صورت اسپور داخلی به عنوان عوامل مهم و مناسبی در کنترل بیولوژیکی مطرح هستند. از سویی یافته های اخیر مبنی بر وجود این باکتری ها به صورت اندوفیت در داخل آوندهای گیاهانی نظیر افرا، افق جدیدی را در راستای استفاده از این باکتری ها به عنوان عوامل بیوکنترل بیماری های آوندی گشوده است(عزیزالله ابراهیمی و مکاران2010)[69] جنس باسیلوس، باسیل های گرم مثبت بزرگی اند که توانایی تولید اندوسپور از مشخصه های بارز آن بوده و هوازی اجباری یا بی هوازی اختیاری می باشند و به دلیل تشکیل اسپور برای سال های زیادی می توانند در محیط باقی بمانند(زینسر و همکاران 1386)[70]. فقط یکی از گونه های این جنس، باسیلوس آنتراسیس، عامل بیماری در انسان و حیوانات است. بسیاری از گونه های دیگر این جنس توزیع وسیعی در طبیعت دارند و در خاک مرطوب، آب و نمونه های گرد و غبار یافت می شوند. این باکتری ها متحرک نبوده و اسپورها در مرکز باکتری قرار دارند. باسیلوس های ساپروفیت از منابع ساده نیتروژن و کربن برای رشد و انرژی استفاده می کنند. اسپورها نسبت به تغییرات محیطی مقاوم هستند و در برابر حرارت خشک و بعضی ضدعفونی کننده های شیمیایی به طور متوسط پایدارند و همچنین درخاک به مدت چند سال باقی می مانند. در کتاب باکتری شناسی برجی 34 گونه متفاوت باسیلوس تشخیص داده شده است. برخلاف اغلب جنس های باکتریال، یکی از خصوصیات منحصر به فرد این جنس ، وجود محدوده ی بسیار وسیع گوانین و سیتوزین مولکول DNA در گونه های متفاوت می باشد. در واکنش های متابولیک ، نیازهای غذایی و محتویات ساختمان دیواره سلولی آن تنوع وجود دارد. در این جنس انواع سایکروفیل، مزوفیل، ترموفیل و نیز گونه های آلکالوفیل، نوتروفیل و اسیدوفیل حضور دارند.علاوه بر این، تقریباًتمام گونه های شناخته شده ی رایج، انواعی از آنزیم های محلول خارج سلولی را ترشح می کنند و برخی ازاعضای جنس باسیلوس به عنوان تولید کننده آنتی بیوتیک اهمیت دارند. بعضی از این آنتی بیوتیک ها(پلی میکسین،باسیتراسین، گرامیسیدین)از نظر بالینی مفید هستند. بقیه ی گونه های درون جنس به لحاظ این که در تولید صنعتی حلال ها، الکل ها، آنزیم ها و ویتامین ها مورد استفاده قرار می گیرند اهمیت دارند. تمایل زیادی در کاربرد صنعتی این ارگانیسم ها وجود دارد لذا اطلاعات زیادی در ارتباط با ژنتیک و فیزیولوژی سلولی باسیلوس جمع آوری شده است(زینسر و همکاران 1386)[71]. جنس باسیلوس به خاطر مقاومت غیر معمولشان نسبت به عوامل شیمیایی و فیزیکی، چرخه تکاملی، حضور همه جایی و همزمان اعضای آن و بیماریزایی باسیلوس آنتراسیس، مورد توجه قرار گرفته است. اندوسپور می تواندبه صورت اسپور آزاد یابه صورت ساختاری درون سلول رویشی باشد. اسپورزاها را می توان به آسانی از منابع مختلف اعم از خاک، آب، غذا و غیره و با تهیه سوسپانسیون و گرمخانه گذاری در 80 درجه سانتی گراد و به مدت 30 دقیقه جدا کرد. سلول های رویشی و دیگر اشکال باقی مانده از قبیل کیست ها و اگزوسپورها معمولاً در آن دما خشک نمی شوند. اندوسپورها مقاوم به گرما می تواند دوباره روی پلیت های با محیط کشت مناسب تلقیح شده و ایزوله ها در عرض 48-24 ساعت بازیابی شوند. خانواده باسیلاسه نخست در سال 1895 توسط فیشر پایه گذاری شد. از جمله ویژگی های اعضای جنس باسیلوس که آن را از دیگراعضای خانواده ی باسیلاسه( از تمام تولید کننده های اندوسپور) مجزامی کند، طبیعت هوازی آنهاست که ممکن است مطلق اختیاری می باشد وهم چنین شکل میله ای و تولید کاتالاز است. از دیگر جنس های مولد اسپور میتوان به اسپور و لاکتوباسیلوس که میکروائروفیل و کاتالاز منفی است. کلستریریوم که بی هوازی بوده و سولفات را احیاء نمی کند، دسولفوتوماکولوم بی هوازی و احیاء کننده سولفات است هم چنین به ترمواکتینومایست هاکه علی رغم تولید اندوسپور ویژگی های بارز اکتینومایست را نشان می دهد اشاره کرد. جدول 1-1- راهنمای آسان برای شناسائی تجربی سویه هایشاخص باسیلو 1-5-2- باسیلوس های خاک و ویژگی های آن ها خاک یکی ازمخازن اصلی جنس باسیلوس است. اعضای این جنس برای سنتز وسیعی از محصولات مهم در پزشکی ، کشاورزی، دارویی و دیگر محصولات صنعتی از قبیل آنتی بیوتیک های مختلف، آنزیم ها، آمینواسیدها و قندها استفاده می شود(ایمان و همکاران2007-2006)[72]. به خاطر تنوع متابولیکی در جنس باسیلوس ، باسیلوس ها قادر به کلنیزه شدن در زیستگاه های مختلف از خاک و حشره گرفته تاانسان هستند. باسیلوس تورنجنسیس انگل حشرات است و به صورت تجاری به عنوان حشره کش استفاده می شود. برخی پاتوژن و برخی دیگر مثل باسیلوس سوبتیلیس به عنوان ساپروفیت مطرح است که درنواحی ریزوسفر حد فاصل بین ریشه های گیاهان وخاک مجاورساکن می باشد ریشه ی گیاهان و بیوفیل همراه می تواند تاثیر معنی داری روی شیمی خاک و ایجاد محیط منحصر به فرد داشته باشد(ویات و همکاران1996)[73]. 1-5-3- رنگ آمیزی گرم برای شناسایی باسیلوس ها یکی از راه های تعیین هویت میکروارگانیسم ها تشخیص میکروسکوپی آن ها بعد از رنگ آمیزی های اختصاصی است باسیلوس ها میکروارگانیسم های گرم مثبتی هستند که رنگ آمیزی آنها معمولاً با روش گرم صورت می گیرد. کلنی های باسیلوس که پس از رنگ آمیزی دارای خصوصیات زیر می باشند: نتیجه ی رنگ آمیزی گرم، مثبت، اسپوردار، شکل تیپیک باسیل می باشد. خصوصیات مورفولوژیکی: کلنی ها معمولاً خشن، چین دار، اطراف نامنظم، مسطح و بر روی محیط پخش می شود. رنگ سفید مایل به کرم است. خصوصیات میکروسکوپی کلنی: باسیل های گرم مثبت اسپوردار، با اسپورهای بیضوی، تخم مرغی، گردمرکزی، نزدیک به انتها یا انتهایی و بعضی ها گرم متغیر می باشند. 1-6- قارچ ها 1-6-1- معرفی کلی ماهیت قارچ ها همه ی قارچ ها ارگانیسم های یوکاریوتی هستند که دارای یک هسته و غشای هسته ای، شبکه ی اندوپلاسمی، میتوکندری و دستگاه ترشحی می باشد. اغلب قارچ ها هوازی اجباری یااختیاری هستند. به طور کلی قارچ ها ارگانیسم های یوکاریوتیک هتروتروف هستند که برای تامین نیازمندی های رشد به ترکیبات آلی از پیش ساخته شده به عنوان منبع کربن نیازمندند. هسته واجد چندین کروموزوم و یک هستک می باشد. دیواره ی سلولی شان حاوی پلیمرهای پلی ساکاریدی کیتین، کیتوزان، گلوکان، منان و در موارد خاص سلولزاست. قارچ ها معمولاً ازباکتری های رشته ای به دلیل اندازه ی بزرگتر، مقاومت نسبت به عوامل ضد باکتریایی مثل پنی سیلین و استرپتومایسین و غیره و حساس بودن نسبت به عوامل ضد قارچی نظیرآمفوتریپسین(ب) و فلوروسیتوزین به آسانی قابل تشخیص هستند. به علاوه قارچ ها برخلاف باکتری ها مورد حمله باکتریوفاژ واقع نمی گردند. به طور کلی قارچ ها واجد ساختمان های پیچیده ای هستند و برخلاف باکتری ها، مشخصات فیزیولوژیک و ایمونولوژیک(به جز معدودی از قارچ های مخمری) در تشخیص آنها حداقل اهمیت را دارد. 1-6-2- اهمیت بالینی قارچ ها در حال حاضر اهمیت قارچ ها از نظر پزشکی به عنوان پاتوژن های انسانی در جهان بر کسی پوشیده نیست. تقریباً بیش از دویست هزار گونه قارچی تاکنون شناخته شده است(زینی. فسا و همکاران1383)[74] ولی کمتر از چهارصد گونه آنها از نظر پزشکی دارای اهمیت هستند و کمتر از پنجاه گونه عامل بیش ازنود درصد عفونت های قارچی درانسان و سایر حیوانات است(بروک و مادیگان1997)[75]. قارچ هایی که سابقاً برای انسان بیماریزا نبودند امروزه، از جمله پاتوژن های فرصت طلب هستند که روزبه روز بر تعدادشان افزوده می شود. این قارچ ها به دلیل تطابق با بسیاری ازشرایط محیطی شان افراد ناتوان و دارای نقص سیستم ایمنی را به راحتی مورد تهدید قرار می دهند و هم اکنون یکی از دلایل مرگ و میر این نوع بیماران بشمارمی روند(زینی. فسا و همکاران1383). قارچ شناسی گذشته منحصر به تعداد محدودی عفونت پوستی بود ولی امروزه شامل بسیاری از عفونت هایقارچی فرصت طلب و ساپروفیت های خاک و هوا می باشد که به سرعت خود را با محیط وفق می دهند. بیماری های قارچی دراثر دسته مهمی از قارچ های کپکی و مخمری درخاک ایجادمی شوند. برخی قارچ ها ساکن طبیعی بدن میزبان هستند مثل کاندیدا آلبیکنس[76] و برخی دیگرسعی در کسب حالت همزیستی مسالمت آمیز دارند(شادزی. شهلا1386)[77] 1-6-3- بیماریزایی قارچ ها بیماری های قارچی را مایکوزیس می نامند. اغلب قارچ های بیماری زا اگزوژن هستند و جایگاه طبیعی آنها آب و خاک و موادآلی هستند. بیماری های قارچی که میزان بروز بالایی دارند مثل کاندیدیازیس و درماتوفیتوزها توسط قارچ هایی که قسمتی از فلورمیکروبی نرمال هستند و یا خود را جهت زندگی در بدن میزبان به خوبی وفق داده اند ایجاد می شود. جهت سهولت، بیماری های قارچی به انواع سطحی، جلدی سیستمیک و فرصت طلب طبقه بندی می شوند. گروه بندی بیماری های قارچی به این شکل منعکس مکان معمول آنها ومحل شروع و ورود قارچ ها می باشد. با این وجود هم پوشانی هم دیده می شود(بروک و مادیگان1997)[78]. 1-6-3-1- کنترل بیماری های قارچی با پیشرفت های پزشکی به طور چشمگیری عمر بیماران سرطانی، ایدزی، پیوند سلول بنیادی افزایش یافته ولی به طورشگفت انگیزی فراوانی بیماری های قارچی فرصت طلب افزایش یافته است. قارچ های بیماری زا قادر به تولید توکسین نیستند ولی مکانیسم بیماری زایی در قارچ ها پیچیده و وابسته به چند ژن است.اغلب درمان بیماری های قارچی مشکل است زیرا قارچ ها یوکاریوت بوده و دارای ژن ها و محصولات ژنی مشابه میزبان های انسانی خود می باشند. بنابراین اهداف منحصر یه فرد کمی جهت شیمی درمانی و آنتی بیوتیک های موثر وجود دارد. خوشبختانه پیشرفت های جالبی در قارچ شناسی پزشکی صورت گرفته و تحقیقات چشمگیری جهت یافتن فاکتورهای بیماری زایی آنها و نیز جنبه های درمانی صورت گرفته است(شادزی.شهلا1386، بروک و مادیگان1997) 1-6-4- معرفی قارچ های مورد آزمایش 1-6-4-1-آسپرژیلوس[79] تاکنون بیش از 900 گونه آسپرژیلوس مورد شناسایی قرار گرفته است. آسپرژیلوس ها مهمترین قارچ های موجود در محیط می باشند که تقریباً درتمام ترکیبات و موادآلی قادر به رشداند و کونیدی آنها به مقدار فراوان در آب و خاک پراکنده است. آسپرژیلوس های بیماری زا: گونه های آسپرژیلوس در ایجاد عفونت های درونی، زیرجلدی، جلدی و ضایعات گوش، چشم و ناخن نقش اساسی دارند. مهمترین گونه های بیماری زای انسان عبارتنداز آسپرژیلوس فومیگاتوس[80]، فلاووس[81]، نیجرنیدولانس[82] و تره ئوس[83] که کلیه این گونه ها به حرارت مقاوم می باشند و قادراندبه راحتی خود را با محیط بافت سازگار و بیماری ایجاد نمایند. گونه های مختلف آسپرژیلوس به ایجاد توکسین های مختلف معروفند(شادزی. شهلا1386). 1-6-4-2- فوزازیوم[84] این جنس قارچی رامی توان به سهولت ازخاک مزارع پنبه یا صیفی کاری ها جدا نمود وهم چنین عواملی هستند که غالباً باعث فساد کدو، خیار، گوجه فرنگی، بادمجان و پنبه می شوند. فوزاریوم یکی از انواع ساپروفیت های شایع می باشد که عامل عفونت های انسان و یا حیوان واقع می شود.در ایجاد کراتیت های قارچی و اونیکو میکوز واجد اهمیت می باشند.فوزاریوم در حیوانات دریایی بیماری ایجاد می نمایند و در گاوها نیز منجر به سقط جنین می شود. مشخصات کلنی: کلنی رشدسریع دارد.در ابتدا سفید و پنبه ای شکل است و تدرجاً به رنگ صورتی یا ارغوانی مبدل می شود.گاه نیز ایجاد رنگدانه منتشر در محیط می نماید. خصوصیات میکروسکوپی : کونیدیوفورها به طور منفرد یا مجتمع قرار دارند.این قارچ ها واجد دو نوع کونیدی است. میکروکونیدی تک سلولی و ماکروکونیدی خمیده و داسی شکل که واجد دیواره ی عرضی می باشد. بیماری زایی: گونه های مختلف فوزاریوم در ایجاد کراتیت و اونیکو میکوز سهیم می باشند.هم چنین فرآورده های توکسیک ایجاد می کنند و در بافت به شکل هیف های واجد دیواره ی عرضی مشاهده می گردند. 1-6-4-3- آلترناریا[85] این قارچ سیاه، ساپروفیت خاک و بیماری زا در گیاه است. کونیدی های پراکنده این قارچ در هوا گاه در انسان ایجاد آسم می نماید. به پوست های مرطوب آسیب دیده نیز گاهی وارد می شود و منجربه ایجاد عفونت می گردد. از سطوح مختلف بدن نیز به فراوانی شده است. امروزه گزارشات متعدد از عفونت های مخاط بینی ضایعات جلدی، اونیکو میکوز، عفونت ریوی و غیره به علت گونه های آلترناریا موجود می باشد. مشخصات کلنی : کلنی رشد سریع دارد و به رنگ سفید، خاکستری، قهوه ای، سبز مایل به سیاه ویا کرکی دیده می شود. رنگ کلنی نیز معمولاً قهوه ای مایل به سیاه است. خصوصیات میکروسکوپی: کونیدی های بزرگ(توتی شکل) با دیواره صاف یا خاردار زنجیروار به دنبال هم قرار گرفته اند و واجد دیواره های طولی و عرضی می باشند. جوان ترین کونیدی در انتهای زنجیره واقع شده است. بیماریزایی: این قارچ را نیز از مایکوزهای جلدی، اونیکومایکوز و سایر ضایعات جدا نموده اند. 1-6-4-4- موکور این قارچ ساپروفیتی است که باعث آلودگی مواد غذایی و بیماری زایی در جانوران می گردد و میسلیوم آن هیالینی و شفاف بدون تیغه ی میانی است. از مقابل نواحی ای به نام گره یا استولون اسپورنژیویوفور ها منشعب می شوند که در انتها به اندامی گرد، بیضی یا فنجانی شکل به نام کلوملا ختم می شوند [1] Perotti 1926 [2] Hallman,j [3] Hot Spot [4] Perotti 1926 [5] Kado 1992 [6] Quispel 1992 [7] Wilson 1995 [8] Pablo. R.Hardoim [9] Hallman,j [10]Hallman,j [11] Pablo. R.Hardoim [12] Mukhopady [13] Sturz 1995 [14] Quadt-Hallmann [15] Hallman,j [16] Pablo. R.Hardoim [17] You et al., 1995 [18] Alcaligenes faccalis [19] Absorbtion [20] Anchoring [21] colonization [22] Betina,V [23] Egoros,N.S- Hallman,j [24] Pablo. R.Hardoim [25] Hurek et al., 1994 [26] Azoarcus sp [27] Hurek,T [28] Quadt et al., 1997b [29] Enterobacter asburia [30] Pseudomonas fluorscens [31] Quadt-Hallmann [32] Bell et al., 1995 [33] Bell [34] Quadt et al., 1997b [35] Pseudomonas fluorscens [36] Enterobacter asburia [37] Bell [38] Quadt-Hallmann [39]Chen et al., 1995 [40] Hallman,j [41] Canny and Huang 1993 [42]Agrobacterium tumefacience [43]Burkholderia solanacearum [44]Serratia spp [45] Betina,V [46] Pablo,R.Hardoim [47] Lamb,T.G [48] bacillus macerans [49] Hallman,j [50] Siciliani,S.D [51] Bird,L.S [52] Quadt-Hallman and Kloepper [53] Mahaffee,W.F [54] Sturz 1995 [55] Curtobacterium citreum [56] Rhizobium leguminosarum [57] Loper,J.E [58] IAA [59] Pablo,R.Hardoim [60] Dong [61] Clavibacter [62] Tomasino et al., 1995 [63] Bacillus thurengiensis [64] Pablo,R.Hardoim [65]Hallman,j [66]Paula Gardiner [67]Paula Gardiner [68] Peterson,C.A [69] Azizollah Ebrahimia [70]Zinser [71]Zinser [72] Eman,A.H [73] Wiwat,C [74] Zeini [75] Brock,T.D.,Madigan,M.T [76] Candida albicans [77] Shadz,Shahla [78] Brock,T.D.,Madigan,M.T [79] Aspergillus [80] Aspergillus fomigatos [81] Aspergillus flavoss [82] Aspergillus nigeridolans [83]Aspergillus tereous [84] Fusarium [85] Alternaria دریافت فایل جداسازی و شناسائی اندوفیت های گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی مارچوبه بومی استان گلستان و تاثیر آنها در گیاهان

پایان نامه بررسی شکل پذیری اعضای ساخته شده از فولاد پرمقاومت و مقایسه آن با فولاد نرمه

پایان نامه بررسی شکل پذیری اعضای ساخته شده از فولاد پرمقاومت و مقایسه آن با فولاد نرمه   پایان نامه مهندسی عمران گرایش زلزله عنوان :بررسی شکل پذیری اعضای ساخته شده از فولاد پر مقاومت و مقایسه ان با فولاد نرم صفحه:153 فصل:5 فصل اول تاریخچه و کاربردهای فولاد پر مقاومت در صنعت مهندسی ساختمان فصل دوم فلسفه شکل پذیری و طراحی لرزه ای اتصالات فصل سوم مطالعات انجام شده بر روی اتصالات ساخته شده از فولاد پرمقاومت فصل چهارم طراحی و مدلسازی اتصالات گیردار با نرم افزارANSYS فصل پنجم جمع بندی نتایج تحلیل ها و ارائه پیشنهادات   sorenafile.ir دریافت فایل پایان نامه بررسی شکل پذیری اعضای ساخته شده از فولاد پرمقاومت و مقایسه آن با فولاد نرمه

سیستم های مدیریت محتوا

سیستم های مدیریت محتوا درود بر شما ممنون از اینکه فروشگاه خودتون رو انتخاب کردید. پروژه پیش رو مربوط به سیستم های مدیریت محتوا می باشد. این پروژه دارای 100 صفحه و به صورت word می باشد.   فهرست مطالب فصل اول CMS 1-1. سیستم های مدیریت محتوا 2-1. چرا شما یک CMS لازم دارید ؟ 3-1. کاربرد عمده سیستم های مدیریت محتوا 1-3-1. Fronted 2-3-1. Backend 4-1. شیوه های مرسوم در ذخیره سازی اطلاعات 1-4-1. شیوه ذخیره سازی خام اطلاعات 2-4-1. شیوه ذخیره سازی اطلاعات بصورت فایل های تغییر یافته یا کد شده 3-4-1. شیوه ذخیره سازی در بانک اطلاعاتی 5-1. مهم‌ترین ویژگی‌های سیستم مدیریت محتوا 6-1. مزایای استفاده از سیستم مدیریت محتوا نسبت به طراحی سایت اختصاصی 1-6-1. صرفه‌جویی در زمان ایجاد و به روزرسانی وب سایت ها 2-6-1. پشتیبانی مطمئن تر 3-6-1. انعطاف‌پذیری بیشتر 4-6-1. امنیت بالاتر وب‌سایت 5-6-1. شما می دانید و می بینید چه چیزی را خریداری می نمایید : 6-6-1. وجود مستندات ، راهنما و آموزش کافی 7-1. انواع سیستم های مدیریت محتوا 1-7-1. سیستم مدیریت محتوای سازمانی 2-7-1. سیستم مدیریت محتوای مولفه ای 8-1. انواع سیستم های مدیریت محتوا به لحاظ نرم افزاری 1-8-1. سیستم مدیریت محتوای صفحه محور 2-8-1. سیستم مدیریت محتوای قابلیت محور 9-1. آشنایی باخصوصیات سیستم های مدیریت محتوا معتبر 1-9-1. ایجاد محتوا 2-9-1. مدیریت محتوا 3-9-1. انتشار و نمایش 4-9-1. قرارداد و داد و ستد 10-1. CMS های اطلاعاتی 1-10-1. وردپرس 2-10-1. سیستم مدیریت محتوای رادیانت 3-10-1. سیلور استریپ 4-10-1. جوملا 5-10-1. تایپو لایت 6-10-1. دروپال 7-10-1. سیستم مدیریت محتوای ساده ساخت فصل دوم وردپرس 1-2. تاریخچه ورد پرس 1-1-2. آمار و ارقام 2-2. وردپرس چیست؟ 3-2. طراحی سایت با وردپرس 1-3-2. زمینه های طراحی و ساخت سایت با وردپرس 4-2. امکانات وردپرس 5-2. ابزار رایگان نصب وردپرس بر روی کامپیوترهای ویندوزی 6-2. نحوه نصب وردپرس برروی سرور محلی 7-2. آموزش کار با وردپرس 1-7-2. تنظیمات اولیه 1-1-7-2. تغییر کلمه عبور 2-7-2. تنظیمات همگانی 3-7-2. استفاده از تاریخ هجری شمسی 4-7-2. تغییر محل ذخیره فایل های آپلودی 5-7-2. جلوگیری از حمله اسپم ها 6-7-2. تغییرنام کاربری 8-2. محیط کار 1-8-2. کار با بخش مدیریت پست 1-1-8-2. ایجاد یک پست 2-1-8-2. آشنایی بانوارابزار 3-1-8-2. آشنائی با پنل انتشار 4-1-8-2. آشنائی با پنل برچسب ها 5-1-8-2. آشنائی با پنل دسته ها 6-1-8-2. آشنائی با تنظیمات دیگر 7-1-8-2. ویرایش یک پست 2-8-2. کار با بخش مدیریت برچسب ها 1-2-8-2. برچسب چیست؟ 2-2-8-2. مدیریت برچسب ها 3-8-2. کار با بخش مدیریت دسته ها 1-3-8-2. مدیریت دسته ها 4-8-2. مدیریت چند رسانه ای ها 1-4-8-2. درج محتوای جدید به کتابخانه 2-4-8-2. مدیریت کتابخانه 5-8-2. مدیریت پیوندها 1-5-8-2. اضافه کردن یک پیوند جدید 2-5-8-2. ویرایش پیوندها 3-5-8-2. آشنائی با پیوند دسته ها 6-8-2. مدیریت برگه ها 1-6-8-2. دلایل استفاده از برگها 2-6-8-2. اضافه کردن یک برگه جدید 3-6-8-2. مدیریت برگه ها 7-8-2. مدیریت دیدگاهها 1-7-8-2. آشنائی با بخش مدیریت دیدگاهها 9-2. امکانات محیط وردپرس 1-9-2. امکانات وردپرس 1-1-9-2. هسته قابل حمل 2-1-9-2. هر اختلاف ساعتی که دارید 3-1-9-2. قابلیت gzip 4-1-9-2. سطح دسترسی 5-1-9-2. مشخصات کاربران 6-1-9-2. نصب و بروزرسانی آسان 7-1-9-2. کاملا دینامیک و انعطاف پذیر 8-1-9-2. منتشر کردن کار شما 9-1-9-2. طراحی و شخصی سازی 10-1-9-2. افزونه ها 11-1-9-2. ساخت محتوا 12-1-9-2. ابزارهای وبلاگ نویسی 13-1-9-2. ارسال مطالب بوسیله ایمیل 14-1-9-2. ستون کناری 15-1-9-2. منتشر کردن کار شما 16-1-9-2. فیدها 17-1-9-2. آدرس دهی برای مطالب شما 10-2. ویژگیهای نسخه های 3 به بعد 1-10-2. ادغام با Wordpress MU 2-10-2. نوع پست دلخواه یا Custom post type 3-10-2. تغییرات در واسط کاربری ثبت نام کاربران 4-10-2. وردپرس 3 با پوسته پیش فرض متفاوت 5-10-2. سرصفحه دلخواه 6-10-2. تغییر پشت زمینه 7-10-2. کوتاه سازی URL 8-10-2. مدیریت منو راهبری 9-10-2. امکان ایجاد template برای نویسندگان یا کاربران 10-10-2. بهبود در Custom Taxonomies 11-10-2. نوار مدیریت 1-11-10-2. صفحه مدیریت آژاکسی 2-11-10-2. پیوند داخلی یا Internal Link 3-11-10-2. Internal Link چیست؟ 4-11-10-2. پیشخوان شبکه ای جداگانه 12-10-2. تگ Quick press Template 13-10-2. قالب پست 14-10-2.ظاهر جدید مدیریت 15-10-2.بهبود در نحوه بروزرسانی 16-10-2.نونما کردن مجدد ظاهر 17-10-2. آپلود جدید برای رسانه ها 11-2. مزایای استغاده از وردپرس 1-11-2. پاسخ سریع به مشکلات امنیتی 2-11-2. دوستی با SEO 3-11-2. استفاده آسان فصل سوم ساخت قالب برای وردپرس 1-3. آموزش ساخت قالب برای وردپرس 2-3. ساختار قالب وردپرس 3-3. مشخصات بلاگ 4-3. عناوین پست ها 5-3.مشخصات پست 6-3. ساید بار 7-3. فرم جستجو 8-3. تقویم 9-3. Footer 10-3. نحوه جدا کردن فایل index.php منابع ضمیمه نحوه نصب xampp   بخشی از پروژه: 1-1. سیستم های مدیریت محتوا سیستم مدیریت محتوا ، ترجمه عبارت content management system یا CMS است ، که به معنای سیستم نرم افزاری ای است که به کمک آن محتوا مدیریت می شود و به نرم افزارهایی گفته می شود که نظام قابل مدیریتی را در ثبت , بروزرسانی و بازیابی محتوا فراهم می آورند . این نرم افزارها الزاما وابسته به وب نیستند و برنامه های کاربردی مدیریت محتوای وب سایت های اینترنتی , صرفا یک نمونه از این گونه سیستم های مدیریت محتوا می باشد. لکن در کشور ما ایران ، بعلت گسترش این شاخه از نرم افزارهای سیستم مدیریت محتوا , عبارت cms تتنها به نرم افزارهای مدیریت وب سایت اطلاق می شود. Cmsیا سیستم مدیریت محتوا چرخه زندگی صفحات وب سایت اینترنتی را از لحظه ایجاد تا زمان انقراض در بر می‌گیرند و به صاحبان این وب سایت ها , که لزوما آشنای با مباحث تخصصی اینترنت , وب و برنامه نویسی تحت وب نیستند ، اجازه می دهند تا بتوانند سایت های خود را به نحوی حرفه ای مدیریت کنند. سیستم مدیریت محتوا تحولی شگرف در زمینه طراحی و مدیریت وب سایت‌های اینترنتی به‌شمار می‌آید. امروزه توقع بینندگان سایت‌های وب بسیار بالا رفته و دیگر مرور وب سایت‌هایی با صفحات ثابت و راکد هیجانی در آنها ایجاد نمی‌کند. امروز کاربران به ‌‌دنبال سایت‌هایی می‌گردند که بتوانند به نوعی در گوشه‌ای از آن سهمی داشته باشند و ارائه محتوی، مطالب و اطلاعات جدید در هر بار رجوع کاربران به وب سایت ، می‌تواند آنها را پایبند سایت نماید. یکی از مشکلاتی که تا امروز به نوعی باعث می‌شد تا افراد کمتری به فکر داشتن یک وب‌ سایت اینترنتی بیفتند هزینه‌های بالای طراحی آن بوده ، به عنوان نمونه برای طراحی وب سایتهای اینترنتی ، سابق بر این تعدادی نیروی متخصص طراح وب ، مشغول طراحی آن در چندین ماه و رفع ایراد و پشتیبانی از وب سایت می شدند لذا هزینه طراحی و پشتیبانی وب سایت بالا بود ، ولی امروزه با در دسترس بودن سیستم های مدیریت محتوا دیگر چنین مشکلی وجود ندارد. در سال 1995 تعداد کاربران اینترنتی تنها 13 میلیون نفر در سراسر جهان را شامل می شد ، این در حالی است که این رقم در سال 2005 یعنی فقط ده سال بعد به 1 میلیلارد نفر رسید . این رشد انفجاری موجب شد تا کاربران زیادی به لزوم استفاده از اینترنت و وب پی برده و در فاصله این سالها ، تعداد صفحات وب بر روی شبکه جهانی وب , به 60 میلیارد صفحه رسید . این نیاز روز افزون ,شرکتهای طراح وب را بر آن داشت تا با طراحی و پیاده سازی نرم افزارهای جامع همه منظوره که منطبق بر نیاز اغلب مشتریان باشد و به صورت قالبی منعطف بتوان بیشتر وب سایتهای اینترنتی را با آنها راه اندازی کرد . این گونه نرم افزارها را بعدها نرم افزارهای مدیریت محتوا یا سیستم مدیریت محتوا (cms) نامیدند .اما ایراد نرم افزارهای مدیریت محتوا این بود که یک تعامل یک سویه با مخاطبان برقرار می نمودند و فقط در راستای ارائه محتوی و اطلاع رسانی به ایشان ، طراحی و پیاده سازی شده بودند . این در حالی بود که بازدیدکنندگان وب ، به دنبال سایتهایی بودند که به نوعی در گوشه ای از آن سهمی داشته باشند . با توجه به این موضوع ، نرم افزارهای مدیریت محتوای تحت وب ، با قابلیت های برقراری ارتباط دو سویه با کاربران ، پا به عرصه وجود گذاشتند و با ارائه سرویسهای دو سویه ، مخاطبان سایت را در بروزرسانی محتوای سایت سهیم کردند .در کشور ما ایران نیز ، پس از استفاده از سیستم های مختلف مدیریت محتوای غیر بومی و انواع نرم افزارهای اینترنتی خارجی ، نیاز مبرمی به نرم افزار مدیریت محتوای بومی احساس می شد تا بتواند منطبق با سلیقه ها ، نیازها ، قوانین و مقررات بانکی و دولتی داخلی , پاسخگوی درخواست مشتریان باشد . با توجه به این مهم ، برخی از شرکتهای داخلی اقدام به طراحی و پیاده سازی نرم افزارهای مدیریت محتوا نمودند . شرکت توسعه مجازی ، یکی از پیشروان این عرصه در کشور محسوب می شود و سیستم مدیریت محتوای parscms را بر همین اساس , طراحی و پیاده سازی نمود . 2-1. چرا شما یک CMS لازم دارید ؟ اگر سایت شما هر چند وقت یکبار (مثلا هر دو هفته) به روز میشود میتوانید بجای اینکه هر بار به یک شرکت طراحی وب مراجعه کنید ، خودتان با نصب یکی از این برنامه های مدیریت محتوا ، تغییراتتان را روی سایت اعمال کنید .اگر شما سایت خود را اصلا بروز نمیکنید ، باید کم کم به فکر بیافتید ، چون بیننده های شما وقتی همیشه با یک صفحه همیشگی روبرو شوند کم کم شما را فراموش می کنند ، چون چیز جدیدی برای عرضه ندارید .اکثر CMS ها در ورژن های مختلف و با قابلیت های مختلف به بازار عرضه می شوند . البته قابلیت بروز کردن اطلاعات در همه مشترک است اما قابلیت های ویژه دیگری دارند که با قیمت های مختلف بشما پیشنهاد می دهند . از جمله: 1-مدیریت اطلاعات فرستاده شده توسط کاربران و تایید اطلاعات 2-چند زبانه بودن 3-ایجاد نقشه سایت داینامیک 4-امکان ایجاد تجارت الکترونیک یا فروشگاه مجازی 5-ایجاد فرم برای دریافت اطلاعات کاربران 6-بهینه سازی تصاویر آپلود شده 7-ایجاد و بروز کردن متا تگ ها 8-امکان جستجو در مطالب سایت 9-امنیت بیشتر 10-گزارش آمار بازدید از صفحات 3-1. کاربرد عمده سیستم های مدیریت محتو به ترتیب کاربرد و اهمیت محتوا به سه بخش کلی زیر تقسیم میشود : 1-محتوای متنی این محتوا شامل اخبار ، مقالات ، کتب و سایر محتواهای متنی از این قبیل میباشد که خود حجم عظیمی از اطلاعات را بر روی وب تشکیل می دهند . 2-محتوای چند رسانه ای این محتوا شامل صوت ، تصویر و فیلم میشود که برای مدیریت آن از استاندارهای خاصی استفاده میشود بهمین دلیل سیستم های مدیریتی در این بخش کاملا تخصصی بوده و عمدتا کاربرد عمومی ندارد. 3-محتوای فایلی این محتوا شامل فایلهای فشرده ، فایلهای اجرایی و کتب الکترونیک میباشد که عمدتا برای نگهداری و مدیریت آن لازم است از استاندارد های خاصی استفاده شود، این نوع محتوا نیز به اندازه محتوای چند رسانه ای کاملا تخصصی بوده و برای مدیریت آن کمتر از سیستم های مرسوم استفاده می شود . سیستم های مدیریت محتوای از جهات دیگری نیز قابل بررسی هستند و آن نوع مدیریت و سطح بندی اطلاعات می باشد ، که پر اهمیت ترین بخش در آشنایی و کار با سیتم های مدیریت محتوا می باشد ، سیستم های مدیریت محتوا عمدتا دسترسی به اطلاعات را در سه بخش کلی در نظر می گیرند که به ترتیب : ایجاد یا ورود اطلاعات ، ویرایش ، مدیریت و انتشار اطلاعات البته هر چه سیستم مدیریت محتوا تخصصی تر باشد. این سطح بندی ها جزیی تر می شود به عنوان مثال ایجاد یا ورود اطلاعات خود می تواند بر حسب نوع و دسته بندی محتوای دارای بخشهای متفاوتی باشد. به عنوان مثال می توان به سیستم گردش خبر در خبرگزاری ها اشاره کرد که در هر بخش اعم از ورود ، ویرایش و انتشار دارای دسترسی های متفاوتی می باشد . نوع دیگر سطح بندی اطلاعات در سیتم های مدیریت محتوا سطح بندی اطلاعات براساس گروههای کاربری است که دارای 2 بخش کلی Fronted و Backend می باشد. در این حالت هر کاربر در خصوص برخورد با محتوا در یکی از این دو دسته بندی قرار خواهد گرفت که در زیر به آن اشاره خواهیم کرد: 1-3-1. Fronted کاربر به عنوان میهمان فرض شده و صرفا به اطلاعات و محتوای بدون سطح بندی یا اطلاعات عمومی (Public) دسترسی دارد . کاربر باید دارای شناسه کاربری یا سطح اولیه دسترسی به اطلاعات باشد که در این حالت کاربر مجاز به دریافت اطلاعات براساس دسترسی بالاتر از میهمان است و می تواند اطلاعات دارای این سطح را با استفاده از نام کاربری و رمز عبور خود دریافت کند عمدتا این سطح از اطلاعات نیز دارای اهمیت زیادی از لحاظ نوع دسترسی نمی باشد . کاربر دارای سطح دسترسی ویژه به اطلاعات بوده و قادر به دریافت اطلاعات با درصد اهمیت بالاتری را داراست که این اطلاعات پس از بررسی های خاص امنیتی به او نمایش داده می شود هرکدام از این سطوح خود نیز دارای زیر بخش های جزیی تر برای دسته بندی اطلاعات بوده که براساس نیاز کاربران هر سیستم مدیریت محتوا متغیر می باشد . 2-3-1. Backend کاربر با امکان ورود اطلاعات این کاربر قادر است تا به پشت صحنه سیستم مدیریت محتوا دسترسی داشته و نقش یک نویسنده تا تولید کننده محتوا را ایفا کند ، این کاربر تمامی دسترسی های بخش Fronted را ممکن است دارا باشد . کاربر با امکان ویرایش مطالب این کاربر به عنوان ویراستار محتوای ورودی عمل کرده و تمامی دسترسی های کاربران قبلی را داراست . کاربر با امکان انتشار مطالب که در واقع جزیی ترین بخش از مدیریت سیستم را داراست و از دسترسی تمامی کاربران قبلی بهره می برد.مدیران جز، مدیران ارشد، تعریف این دو سطح دسترسی به ساختار دسترسی ها در سیستم مدبریت محتوا بر می گردد. سیستم های مدیریت محتوای از جهاتی دیگری نیز قابل بررسی هستند که از آن جمله شیوه ذخیره سازی محتوا آنهاست. 4-1. شیوه های مرسوم در ذخیره سازی اطلاعات 1-4-1. شیوه ذخیره سازی خام اطلاعات در این شیوه اطلاعات بدون هیچ گونه تغییری و با فرمت اصلی ذخیره می شود ، این شیوه از لحاظ امنیتی دارای اشکالات فراوانی می باشد که آن جمله به عدم کنترل دسترسی به محتوا می توان اشاره کرد . 2-4-1. شیوه ذخیره سازی اطلاعات بصورت فایل های تغییر یافته یا کد شده در این شیوه برای امنیت بیشتر اطلاعات تغییر شکل داده و از فرمت اصلی خود خارج می شود تا دسترسی به سورس اطلاعات تقریبا غیر ممکن شود ، عیب این شیوه عدم امکان پردازش های موازی بر روی اطلاعات می باشد . 3-4-1. شیوه ذخیره سازی در بانک اطلاعاتی در این شیوه اطلاعات با فرمتی خاص در بانک های اطلاعاتی دخیره شده و قابلیت پردازش و تعیین سطح دسترسی را دارا هستند ، این شیوه جزء پرکاربردترین شیوه در ذخیره اطلاعات بوده و دارای ضریب امنیتی بالایی نیز می باشد . سیستم های مدیریت محتوا نسبت به نسل های اولیه خود کاملا تغییر یاقته اند و قادر شده اند تا بصورت همزمان و با استفاده از امکانات جدید انواع محتوا را بسادگی مدیریت و کنترل نمایند بدین ترتیب به جای استفاده از چندین سیستم مدیریت محتوا کافی است تا یک سیستم را با امکانات تکمیلی استفاده کرد به عنوان مثال سیستم مدیریت محتوای میترا قادر است تا یصورت همزمان محتوای متنی ، تصویری ، صوتی و فایلی را با هم مدیریت و سطح بندی نماید ، این سیستم مدیریت محتوا جزء نسل جدید سیستم های مدیریت محتوا که کاملا می تواند جایگزین سیستم های مدیریت محتوای قبلی باشد ، ساختار این نرم افزاری طوری طراحی شده که بتواند بطور همزمان چند نوع محتوا را به چند زبان در اختیار کاربر بگذارد بدون اینکه در ارایه مطالب اشتباهی رخ دهد ، همچنین قادر است تا اطلاعات و محتوا را با سطوح مختلف دسترسی دسته بندی نموده و در اختیار کاربران قرار دهد ، این سیستم مدیریت محتوا کاملا رایگان بوده و با استاندارد های فارسی سازگاری کامل را دارد و می تواند به عنوان بهترین انتخاب برای مدیریت محتوا بر روی وب در نظر گرفته شود . 5-1. مهم‌ترین ویژگی‌های سیستم مدیریت محتوا -اقلام اطلاعاتی و ارتباط بین آنها را مدیریت می‌کند. -امکان تعریف هر جز (یا صفحه) و موقعیت‌ آنها بر روی سایت را در اختیار کاربر قرار می‌دهد. -ارتباطات مورد نیاز و کامل بین صفحات و اطلاعات موجود در آنها را ایجاد می‌کند. -ایجاد و ویرایش صفحات، کارکرد اصلی این سیستم است. -بین دسترسی‌ و بایگانی یکپارچگی ایجاد می‌کند. -دارای موتوری برای انتشار و ایجاد صفحات اینترنتی‌ست.  6-1. مزایای استفاده از سیستم مدیریت محتوا نسبت به طراحی سایت اختصاصی در موارد نادری ، ممکن است وب سایتی که در نظر دارید تا طراحی و پیاده سازی نمایید ، در بستر سیستم های مدیریت محتوا قابل تعریف نباشد (وب سایت خاص منظوره) که طبیعتا نیاز به برنامه نویسی اختصاصی خواهید داشت. ولی در اکثر مواقع وب سایتی که می خواهید , با استفاده از سیستم های مدیریت محتوا ی موجود قابل اجراست . مزایای استفاده از نرم افزار سیستم مدیریت محتوا (cms) , نسبت به طراحی سایت اختصاصی عبارت اند از : 1-6-1. صرفه‌جویی در زمان ایجاد و به روزرسانی وب سایت ها در حالی که طراحی و پیاده سازی یک وب سایت اینترنتی به صورت اختصاصی , ماهها به طول می انجامد ، قراردادن اطلاعات سایتتان در قالب یک سیستم مدیریت محتوا (cms) از پیش طراحی شده ، بیش از یکی دو هفته طول نخواهد کشید . این صرفه جویی در زمان ، احتمالا محرک بسیار خوبی برای طراحی وب سایت شما با یک نرم افزار مدیریت محتوا یا cms است .یک سیستم مدیریت محتوای حرفه ای کلیه نیازهای مشتریان را پیش بینی کرده و پس از درخواست مشتری برای طراحی وب سایت ، کافی است نسخه ای از یک وب سایت طراحی شده توسط نرم افزار cms ، بر روی وب قرار گیرد . با این توصیف هزینه طراحی و پیاده سازی یک وب سایت اینترنتی به شدت کاهش می یابد . 2-6-1. پشتیبانی مطمئن تر با توجه به اینکه طراحی وب سایتهای اختصاصی ، معمولا یک بار برای شما و متناسب با نیاز شما انجام می شود و برای سایرین کاربردی ندارد ، لذا چنانچه تیم طراح سایت از پشتیبانی آن سر باز زد ، کس دیگری نیز نخواهد توانست وب سایتی که دیگران نوشته اند را پشتیبانی کند لذا نمی توانید تجارت خود را بر این اساس پایه ریزی نمایید . این در حالی است که شرکتهای طراحی وب سایت که صاحب سیستم های مدیریت محتوا می باشند ، با تعداد زیادی مشتری مواجه اند که قبلا برای ایشان از این نرم افزار استفاده نموده اند . طبیعتا این شرکتها می بایست پشتیبانی کاملی از سیستم مدیریت محتوای خود به عمل آورند تا شانس باقی ماندن در بازار پر رقابت امروز را داشته باشند. دریافت فایل سیستم های مدیریت محتوا

خرید 1k ممبر واقعی تلگرام

خرید 1k ممبر واقعی تلگرام فروش 1000 ممبر واقعی + 100 ممبر هدیه برای تلگرام همراه با بازدید تحویل در کمتر از 12 ساعت دقت کنید تمامی ممبر ها واقعی هستند و بازدید هم دارند ما مخالف روش فیک هستیم و تلگرام هم فیک ها رو پاک خواهد کرد تله ویتی مفتخر است برای اطمینان شما  10 تا ممبر به صورت تست بزند (برای درخواست ممبر تستبه ما پیام دهید) قیمت های ما تا یه مدتی 50 درصد تخفیف دار هست بعد یه مدت قیمت بر میگرده رو حالت قبل پس الان از فرصت استفاده کنید و همچنین با جوین شدن در کانال تلگرامی ما از اخرین اخبار و تخفیفات ما با خبر شوید برای جوین شدن کلیک کنید دریافت فایل خرید 1k ممبر واقعی تلگرام

جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ ترکیبات ضدمیکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران

جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ ترکیبات ضدمیکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران چکیده اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است.هدف ازاینتحقیقجداسازیاکتینومیست‌هایتولیدکنندهمتابولیت‌های فعال ازرسوبات بستر دریای مازندرانوبررسیپتانسیلتولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسطاینارگانیسم‌هامی‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسطروش‌هایمورفولوژی ومیکروسکوپیکلنی‌ها،شناسایی و جداسازی شدند.غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسیفعالیت این عصاره خامعلیه باکتری‌ها و قارچ‌هایبیماریزاو باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک بااستفادهازروش انتشار در دیسک بررسیشد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایهدارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp.Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد. کلمات کلیدی:اکتینومیست‌های دریایی، فعالیت ضد میکروبی، دریای مازندران فهرست مطالب عنوان صفحه 1- مقدمه. 2 1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک 2 1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها5 1-1-2- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک... 7 1-1-3- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک... 7 1-1-4- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک... 8 1-2-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیستی.. 8 1-2-1- کشف ترکیبات فعال زیستی.. 9 1-2-2- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت.. 9 1-3- روش‌های نوین کشف دارو 10 1-3-1- منابع برای داروهای جدید. 10 1-3-2- روند کنونی کشف دارو. 10 1-3-3- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید. 11 1-3-4- استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها14 1-4- علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی 14 1-5- اکتینومیست‌ها14 1-5-1- ویژگی‌ اکتینومیست‌ها15 1-5-2- مورفولوژی اکتینومیست‌ها16 1-5-3- فیزیولوژی اکتینومیست‌ها17 1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها18 1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها19 1-5-6- متابولیت‌های ثانویه. 20 1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال. 21 1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست.. 23 1-5-8- اهمیت استرپتومیسس‌ها24 1-5-9- اکتینومیست‌های دریایی.. 25 1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی.. 27 1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید. 28 1-6- اهداف پژوهش 29 2- مواد و روش‌ها:32 2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات 32 2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز 33 2-3- جمع‌آوری نمونه 36 2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها37 2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها38 2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی 38 2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت.. 38 2-6-2- روش نگهداری بلند مدت.. 38 2-7- شناسایی باکتری‌ها39 2-7-1- بررسی مورفولوژی.. 39 2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم. 39 2-7-3-تولید پیگمان محلول 40 2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی 40 2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست 41 2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی 41 2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال. 41 2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال. 42 2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک... 43 2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین. 43 2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال 44 2-13- استخراج نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر 44 2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد 45 2-15- تکثیر ژن rDNA16S 46 2-15-1- برنامه PCRبرای ژن‌های 16S rDNA:46 2-16- تخلیص محصول PCR 47 2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA 47 2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:47 2-17-2- انجام BLAST. 48 2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA.. 48 3- نتایج.. 50 3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها50 3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال 52 3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا55 3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال 56 3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک 58 3-6-فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)59 3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها61 3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها61 3-9-تولید پیگمان محلول 65 3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز 66 3-11- تکثیر ژن 16s rDNAجدایه‌های فعال 67 3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA.. 68 4- بحث و پیشنهادات.. 73 4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی 75 4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال 75 4-3- استخراج متابولیت‌ها76 4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال 76 4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین 77 4-6- مورفولوژی کلنی‌ها78 4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA 79 4-8- جمع بندی 79 4-9-پیشنهادات 8 فهرست اشکال شکل 1-1. متابولیت‌های اولیه و ثانویه و زمان تشکیل این ترکیبات در نمودار رشد باکتری‌ها.20 شکل 2- 1- خط کش ژنی یک kb. 35 شکل3- 1. درصد فراوانی جدایه‌های اکتینومیست جداشده از نمونه‌ رسوبات بستر دریا بر حسب عمق آب.. 51 شکل 3-2 سویه MN2جداشده از رسوبات بستر دریای مازندران. 51 شکل3-3. درصد فراوانی جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا در غربالگری اولیه. 54 شکل3- 4. غربالگری اولیه با روش cross-streak.54 شکل 3-6. فعالیت ضد قارچی عصاره خام استخراج شده از جدایه‌ها.58 شکل 3-7. اثر سینرژیسمی عصاره خام سویه MN2با آنتی بیوتیک تتراسایکلین.59 شکل 3-8. هاله عدم رشد دیسک‌های آغشته به عصاره خام استخراج شده از جدایه‌های فعال علیه MRSA.60 شکل 3-9 . فعالیت آنزیمی جدایه MN2 .61 شکل 3-10 . وضعیت اسپور: تولید اسپور منفرد توسط جدایه MN2 (A)و اسپور زنجیره‌ای توسط جدایه (B).MN3. 63 شکل 3-11 . شکل انشعابات اسپور: تولید اسپور ساده توسط جدایه MN2 (B)و اسپور منشعب توسط MN38(A).63 شکل 3-12 . ظاهر کلنی‌ اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال MN38. 64 شکل3-13. اکتینومیست رشته‌ای: شکل سلول‌های سویه MN2رنگ‌آمیزی شده64 شکل 3-14. تولید پیگمان محلول رنگی توسط جدایه‌های فعال.65 شکل 3-15. الکتروفورز نوکلئیک اسید استخراج شده از 7 سویه فعال اکتینومیست‌های جداشده بر روی ژل آگاروز. 67 شکل 3-16. الکتروفورز تکثیر ژن 16SrDNAبه کمک ژل آگاروز .68 شکل 3-17. . دندوگرام توالی ژن 16S rDNAجدایه‌های فعال.71 فهرست جداول جدول 1-1. دسته‌بندی دارو‌های ضد میکروبی و نحوه‌ی اثر آن‌ها7 جدول 1-2- . ترکیبات جدید کشف شده از اکتینومیست‌های دریایی.. 29 جدول 2-1. مشخصات جغرافیایی و عمق محل نمونه‌برداری در دریای مازندران.36 جدول 2-2- ترکیب محیط‌های کشت.37 جدول 3-1- توالی پرایمرهای PAو PH برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز. 46 جدول3- 2. غربالگری اولیه اکتینومیست‌های جداشده از رسوبات بستر دریا با روش cross-streak.53 جدول 3-3. غربالگری ثانویه با استفاده از عصاره خام استخراج شده از جدایه‌های فعال. 56 جدول 3-4. فعالیت ضد قارچی عصاره خام جدایه‌های اکتینومیست فعال. 57 جدول 3-5.فعالیت ضدباکتریایی عصاره خام استخراج شده از جدایه‌ها علیه استافیلوکوکوس اورئوس‌مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) و استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از بیماران به روش دیسک دیفیوژن.60 جدول 3-6. مورفولوژی اسپور و رنگ کلنی‌ جدایه‌ها62 جدول 3-7. نتایج بررسی BLASTتوالی جدایه‌ها و شباهت آن‌ها در بانک اطلاعاتی NCBIو EzTaxon. 69 فصل اول 1- مقدمه 1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ - ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه [1]برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ[3] ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز[5]اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت. آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌هاگرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور[8] و رابرت کخ[9] باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفیکردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند. اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک[10] در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام کارهای معمول آزمایشگاهی که می‌بایست کشت‌های باکتریایی را که در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد کرده بودند زیر میکروسکوپ بررسی کند، متوجه شد که در یکی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد که ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود که وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تکه‌ای کپک به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت که کپک چیزی تولید می‌کند که باعث مرگ باکتری‌های استافیلوکوکوس[11] در ظرف کشت شده بود. فلمینگ کپک را جدا کرد و آن را به عنوان یکی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم[12] شناخت، و ماده آنتی بیوتیکی را که تولید می‌کرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد که پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلکه عاملی شد تا برای کشف آنتی بیوتیک‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از ترکیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد. در سال 1945 جایزه نوبل در پزشکی به طور مشترک به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009).با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین[16] در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین[18] در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس[19]، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004). استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن[20]،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003). 1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال[21] که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک[22] که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند. 1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری:باکتری‌ها یک لایه خارجی سخت دارند که دیواره سلولی آنها است و شکل میکروارگانیسم را تعیین می‌کند و از سلول باکتری که فشار اسموتیک بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها. 1-1-1-2- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود وریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30Sریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین). 1-1-1-3- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند. 1-1-1-4- تغییر در عملکرد غشاء سلولی:سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یک غشای سیتوپلاسمی محصور شده که به‌عنوان یک غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌کند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مکانیسم اثر پلی‌میکسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باکتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی که با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، کلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره کرد. جدول 1-1. دسته‌بندی دارو‌های ضد میکروبی و نحوه‌ی اثر آن‌ها نحوه عملکرد دارو‌ها آنتی بیوتیک‌ها جلوگیری از ساخت دیواره سلولی پنی‌سیلین ها، سفالوسپورین‌ها،ایمی‌پنم، آزترئونام ، انکومایسن ،سیکلوسرین و باسیتراسین مهار پروتئین سازی کلرآمفنیکل، اریترومایسین، کلیندامایسین، تتراسایکلین و آمینو‌گلیکوزید ها جلوگیری از ساخت اسیدهای نوکلئیک سولفونامید ها،تری متوپریم، کینولون ها و ریفامپین تغییر در عملکرد غشاء سلولی پلی میکسین، آمفوتریسین B، نیستاتین و کتوکونازول سایر مکانیسم های اثر ایزونیازید، مترونیندازول، اتامبوتول، پیرازینامید، گریزوفولوین و پنتامیدین 1-1-2- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر[23]و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به 50 ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن 100 کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از 20 کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود 1% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989). 1-1-3- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک با نگاه به پژوهش‌های انجام شده در کنترل بیولوژیکی دو دهه گذشته ،روشن است که باکتری‌ها به عنوان عوامل کنترل زیستی، بخصوص باکتری‌های تولید کننده آنتی بیوتیک، نقش مهمی را ایفا کرده‌اند. عوامل موثر در تولید آنتی بیوتیک در دو دسته عوامل درونی میکروارگانیسم و عوامل محیطی تقسیم می‌شوند (Raaijmakers, 2002). طیف گسترده ای از عوامل درونی میکروارگانیسم، از جمله سیستم نظارتی دو جزئی GacA / GacS (Gaffney, 1994)، تراکم سلولی N-آسیل هموسرین لاکتون (Wood, 1997) و سیگما فاکتورها (Sarniguet, 1995) بر تولید آنتی بیوتیک و ترکیبات فعال زیستی تاثیر دارد. از جمله عوامل فیزیکی که بر تولید آنتی بیوتیک اثر می‌گذارد شامل دما، رطوبت خاک ، و pH است ((Shanahan, 1992 . 1-1-4- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک یک آنتی بیوتیک خوب و موثر دارای خصوصیات زیر است: سمیت انتخابی: تنها علیه میکروب‌ها موثر بوده و به سلول‌های میزبان آسیب نرساند. نبود واکنش‌های آلرژیک حجم بالای توزیع در خون، سیتوپلاسم و مغز نیمه عمر طولانی عمر قفسه‌ای طولانی مقاومت میکروبی پائین طیف اثر وسیع 1-2-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیست بررسی‌های اخیر حاکی از آن است که سیستم‌های ژنتیکی در میکروارگانیسم‌ها، قادر به برنامه‌ریزی برای مقابله با عوامل تهدید کننده حیات آن‌ها، می‌باشد. بر این اساس گونه‌های مقاوم میکروبی در حال ایجاد و گسترش‌اند. این موضوع می‌تواند بشر را در آستانه ورود به یک فاجعه پزشکی قرار دهد و چه بسا یک عفونت کوچک، به‌دلیل نبودن داروهای موثر تبدیل به بیماری مرگبار شود. از طرفی هنوز تعدادی از بیماری‌های قارچی، باکتریایی، ویروسی و انگلی وجود دارند که داروی موثر علیه آن‌ها شناخته نشده است. از این رو حتی درآغاز قرن21، با آن‌که عصر طلایی آنتی‌بیوتیک‌ها سپری شده است، هنوز ترکیبات فعال میکروارگانیسم‌ها می‌تواند برای تولید آنتی‌بیوتیک‌های جدید زمینه مناسبی برای تحقیقات کاربردی به ‌شمار آید از میان 150 گروه آنتی بیوتیک موجود در بازار تنها چهار مکانیسم اثر مختلف وجود دارد که آنتی بیوتیک از آن طریق سلول‌های باکتری را تحت تاثیر قرار می دهد. یکی از عوامل کاهش سرمایه‌گذاری در تحقیقات مربوط به کشف آنتی بیوتیک بازده طولانی حدود 10 سال از کشف تا آغاز تولید تجاری مواد ضد میکروبی می باشد (Berdy, 2005). 1-2-1- کشف ترکیبات فعال زیستی حدود یک چهارم از یک میلیون ترکیب فعال زیستی شناخته شده از طبیعت‌، حداقل در یک نوع سنجش زیستی از خود فعالیت نشان داده اند (Berdy, 2005). ترکیبات فعال طبیعی برای برهم‌کنش‌های خاص بین موجودات زنده تکامل یافته و در طبیعت ظهور پیدا کرده اند. مهمترین ویژگی این ترکیبات توانایی تجاری شدن بدون اعمال تغییرات شیمیایی و تنوع مولکولی نسبت به مجموعه های سنتزی و نیمه سنتزی، تنوع محصولات طبیعی می‌باشد. لذا کشف این ترکیبات می‌تواند گامی مهم در صنعت دارویی و پزشکی باشد (Demain, 2006). 1-2-2- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت با وجود مزایای زیاد، محدودیت‌هایی وجود دارد که موجب کندشدن سرعت کشف ترکیبات فعال زیستی از طبیعت می‌شود از جمله (Feher, 2003): به علت ناپایدار بودن بسیاری از این ترکیبات، در حین جداسازی ممکن است غیرفعال شود. بدست آوردن مقدار کافی از ترکیبات تولیدی در طبیعت، دشوار است. جداسازی دوباره ترکیبات به دلیل ساختار پیچیده آن‌ها مشکل است. به علت ساختارهای پیچیده این ترکیبات‌، تغییر شیمیایی در آن‌ها آسان نیست. 1-3- روش‌های نوین کشف دارو یکی از روش‌های نوین در کشف دارو بهینه سازی شرایط کشت برای دسترسی به متابولیت‌های جدید تولید شده از گونه‌های میکروبی می‌باشد. راهکار دیگر، غربالگری‌های ژنومی با کارایی بالا است. در این روش ژن های کد کننده متابولیت‌های ثانویه را مشخص ساخته و روند انتخاب سویه‌های مولد را آگاهانه‌تر می‌سازد. از دیگر روش ها بیوسنتز ترکیبات که از طریق تغییر در ژنهای مسیر تولید مانند دومین‌های پذیرنده سوبسترا که منجر به تولید ترکیبات متنوع‌تر توسط سویه‌ها می‌شود. یکی از راه‌های رسیدن به ترکیبات فعال جدید اصلاحات شیمیایی در ترکیبات از پیش شناخته شده و رسیدن به ترکیبات فعال جدید می‌باشد (Hayakawa, 1988). 1-3-1- منابع برای داروهای جدید کشف داروهای مدرن بر اساس سه منبع اصلی استوار است: محصولات طبیعی، نیمه سنتزی که مشتق شده از محصولات طبیعی بوده و ترکیبات مصنوعی به دست آمده از علم شیمی ترکیبی امروزه. اکثریت آنتی بیوتیک های مربوطه در درمان بالینی، محصولات طبیعی و یا از ترکیبات مشتق شده از آن است. در طول 20 سال گذشته، 60درصد از 877 دارویی که به بازار رسیده اند از محصولات طبیعی بوده‌اند (Lefevre, 2005). 1-3-2- روند کنونی کشف دارو تحقیقومطالعهبررویآنتی‌بیوتیک‌های جدیدوسایرمتابولیت‌هایمیکروبیمؤثردرفعالیت‌های زیستیبهدلیلدارابودنپتانسیلاستفادهدرکشاورزی، مصارفداروییوکابردهایصنعتیپیوستهروبهافزایش می‌باشد (Hayakawa, 1988).دراینمیانباکتری‌هایجنساسترپتومایسس همچنانبهعنوانیکیازمنابعاصلی تولیدکنندهمتابولیت‌های جدیدزیستیموردتوجههستند (2003 ,Takahashi). بیش از 90 درصد ترکیبات فعال زیستی جدا شده را ترکیبات از پیش شناخته شده تشکیل می‌دهد (Zaehner, 1995). در صورتی که تلاش برای کشف آنتی بیوتیک‌های جدید افزایش نیابد شیب نمودار کشف آنتی بیوتیک‌ها در یک یا دو دهه آینده به سمت صفر حرکت می‌کند که این یک چالش بزرگ در درمان بیماری‌های جدید با میکروارگانیسم‌های مقاوم به دارو می‌باشد. 1-3-3- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید در گذشته موفقیت‌های در درمان بیماری‌های عفونی با کمک آنتی بیوتیک‌ها بدست آمده است. امروزه به دلیل مقاوم شدن میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا به آنتی بیوتیک‌های موجود در صورتی که تلاش برای معرفی ترکیبات ضد میکروبی جدید صورت نگیرد در آینده با مشکلات جدی در درمان بیماری‌ها مواجه خواهیم شد. بروز پاتوژن‌های مقاوم به دارو بویژه در مراکز درمانی خطر جدی برای افرادی است که در بیمارستان‌ها بستری می‌شوند. بخصوص افرادی که دارای سطح ایمنی پایین یا مبتلا بیماری‌های مزمن می‌باشند(Mainus, 2001). نتایج حاصل از یک مطالعه بالینی 122 بیمار مبتلا به عفونت سیستمیک استافیلوکوکوس اورئوس که در سال 1941 منتشر شد (درست قبل از معرفی پنی سیلین ) نزدیک به 82درصد مرگ و میر داشت و از 40 نفر که سن بالاتر 40 سال داشتند تنها یک نفر زنده ‌ماند. درمان به وسیله آنتی بیوتیک‌ها تا به حال تاثیر فوق العاده بر طول عمر و کیفیت زندگی انسان داشته است. عفونت باکتری مانند ذات الریه، تیفوس، طاعون، وبا، سیفلیس و سل که زمانی علل اصلی مرگ و میر در جهان به شمار می‌رفت، در حال حاضر به طور موثر به کمک داروهای در دسترس، درمان می‌شود(Skinner, 1941): در دوران طلایی کشف آنتی بیوتیک ظهور باکتری‌های پاتوژن مقاوم به آنتی بیوتیک نظیر پنی سلین، باعث ایجاد نگرانی شد. ولی با توجه به عرضه مداوم داروهای جدید نگرانی کمی وجود داشت. توسعه مجموعه‌ای از آنالوگ‌های آنتی بیوتیک‌ها مانند آنالوگ نیمه سنتتیک متی سیلین که از آنتی بیوتیک پنی سیلین به دست آمده در سال 1960، گسترش یافت اما به زودی باعث ظهور استافیلوکوکوس مقاوم به متی سیلین شد. امروز، استافیلوکوک مقاوم به متی سیلین (MRSA)، انتروکوک مقاوم به وانکومایسین (VRE)و سودوموناس آئروجینوزا مقاوم به فلوروکینولون در بیمارستان و جامعه به عنوان باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک های موجود شناخته می‌شوند (Boucher, 2009). مقاومت به آنتی بیوتیک به عنوان یک مشکل برای درمان انسان در حال حاضر معرفی می‌شود از طرفی، افزایش در تعداد، تنوع و طیف وسیعی از میکروبهای مقاوم در برابر آنتی بیوتیک است که باعث وضعیت فعلی مخاطره آمیز شده است. مقاومت باکتریایی به دو روش بین جوامع میکروبی انتقال می‌یابد (Bennett,2008). انتقال عمودی: از طریق جهش‌های خودبخودی و انتخاب جهش‌یافته‌های مقاوم از طریق تکامل و انتخاب. انتقال افقی: انتقال ژن‌های مقاومت به باکتری‌های دیگر از طریق پلاسمید(conjugation)، فاژ(transduction)، ترانسپوزون(mobile genetic elements) و ترانسفورمیشن(nakedDNA) صورت می‌گیرد. با وجود هشدار مقاومت آنتی بیوتیکی، لیست ترکیبات آنتی باکتریال جدید بسیار اندک است. در سال 2006، تنها یک عامل ضد باکتری جدید دورپنم[24] در ایالات متحده آمریکا برای درمان، قرار گرفته است (Wright, 2007). در سال 1940 اولین بتا لاکتاماز شناخته شد و باعث شد در 1945 نزدیک به 50 درصد از استافیلوکوکوس‌ اورئوس‌ به آنتی بیوتیک پنی سلین مقاوم شدند. باکتری از طریق 4 مکانیسم اصلی در بروز مقاومت نسبت به عوامل ضدمیکروبی نقش دارد که شامل(2006 ,(Singh تخریب یا غیر فعال کردن آنزیمی: باکتری آنزیمی تولید می‌کند که موجب تخریب آنتی بیوتیک می‌شود. ژن این نوع مقاومت اکثرا از طریق پلاسمید منتقل می‌شود. برای مثال پلاسمیدهای مسئول مقاومت نسبت به پنی‌سیلین و سفالوسپورین‌ها دارای ژن‌های مربوط به سنتز آنزیمی به نام بتالاکتاماز یا پنی‌سیلیناز می‌باشند که حلقه بتالاکتام را تخریب کرده و ترکیب غیرفعالی به نام اسید پنی‌سیلوئیک یا اسید فنولیک باقی می‌گذارد. انتقال این نوع پلاسمید در استافیلوکوک‌های مقاوم به پنی سیلین با مکانیسم ترانسداکشن صورت می گیرد. تغییر در جایگاه هدف دارو: میکروارگانیسم گیرنده‌های خود را که برای دارو لازم است تغییر می‌دهد. معمولا ژن این نوع مقاومت، کروموزومی است. برای مثال مقاومت به آمینوگلیکوزیدهایی‌که منشا کروموزومی دارند. با از دست دادن یا عوض شدن پروتئین‌هایی که در قطعه‌ی 30Sریبوزوم به عنوان گیرنده دارو عمل می‌کنند باعث مقاومت به این داروها می‌شوند. کاهش ورود آنتی‌بیوتیک: میکروارگانیسم، نفوذپذیری خود را نسبت به دارو عوض می‌کند. برای مثال تتراسایکلین در باکتری‌های حساس تغلیظ می‌شود ولی در باکتری‌های غیرحساس تغلیظ نمی‌شود . ژن این نوع مقاومت پلاسمیدی است. توسعه راه‌های متابولیکی مقاوم: میانبرهای متابولیکی که در آن سلول از یک راه متابولیکی دیگر به جای راه متابولیکی که توسط دارو مهار شده استفاده می‌کند انسان نیز باعث افزایش مقاومت میکروبی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های موجود می‌شود. انسان با فعالیت‌های زیر در افزایش مقاومت میکروبی دخالت دارد که شامل (Hopwood, 2007): تجویز بیش از حد آنتی بیوتیک درمان بیش‌ازحد طولانی با آنتی بیوتیک‌ استفاده از دوز بیش ازحد کم داروها قطع مصرف آنتی بیوتیک قبل از تکمیل درمان 1-3-4- استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها آنتی‌بیوتیک‌هایی که به صورت توام به‌کار می‌روند باعث ایجاد 3 حالت می‌شوند. حالت اول ادتیو[25] که اثر داروی ترکیبی برابر با مجموع اثر تک تک داروها است. حالت دوم سینرژیسمی، که اثر داروی ترکیبی از مجموع اثر تک تک داروها به تنهایی بیشتر است و حالت سوم آنتاگونیسمی که داروها همدیگر را مهار می‌کنند. دلایل زیادی برای استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها وجود دارد از جمله درمان عفونت‌های خطرناک، ممانعت از بروز مقاومت در باکتری، افزایش فعالیت ضد باکتریایی و کاهش دوز سمی داروها می‌باشد. 1-4- علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی در میان منابع طبیعی مختلف موجود برای جداسازی ترکیبات فعال زیستی میکروارگانیسم‌ها بویژه قارچ‌ها ، اکتینومیست‌ها ، جلبک‌ها و سیانوباکترها اهمیت دارند. ترکیبات فعالی که در صنایع دارویی استفاده می‌شود اغلب از میکروارگانیسم‌ها بدست می‌آید. ترکیبات جدا شده از میکروارگانیسم‌ها دو ویژگی دارد. یکی تنوع شیمیایی زیاد و دیگری پیچیدگی زیاد این ترکیبات می‌باشد. میکروارگانیسم‌ها منبع غنی را برای کشف داروهای جدید تشکیل می‌دهند. (Cragg, 2005) 1-5- اکتینومیست‌ها اکتینومیست‌ها بزرگترین شاخه تکاملی مولدین ترکیبات فعال زیستی می باشند. بیش از 70 درصد از متابولیت های فعال طبیعی از این باکتری ها بدست می‌آیند که البته نزدیک به 70 درصد این ترکیبات از جنس استرپتومایسس این خانواده به دست می آید. در میان میکروارگانیسم‌ها، اکتینومیست‌ها بیشترین مقدار ژنوم را به سنتز متابولیت‌های فعال ثانویه اختصاص داده اند (Bently, 2002). اکتینومیست‌ها به خاطر تولید طیف وسیعی از متابولیت‌های ثانویه، از نظر اقتصادی و بیوتکنولوژی دارای اهمیت می‌باشند. از جمله متابولیت‌های شناخته شده اکتینومیست‌ها می‌توان به ترکیبات ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد سرطان، ضد جلبک و ضد مالاریا اشاره کرد (Valli, 2012). استرپتومایسس‌ها گروهی از اکتینومیست‌ها می‌باشند که به خاطر توانایی تولید و سنتز آنتی بیوتیک‌ها همواره مورد توجه بوده‌اند. استرپتومایسس‌هاقادرند بسیاریازترکیباتشاملقندها،الکل‌ها،آمینواسیدها وترکیباتحلقویراتوسطآنزیم‌هایهیدرولیتیک خودمتابولیزه کنند(Abdisofiyayi, 2011). اولین آنتی‌بیوتیک جداشده از اکتینومیست‌ها استرپتومایسین، تولید شده توسط باکتریاسترپتومایسس[26]، کهدرسال1940توسطواکسمن[27]و همکارانکشف شد. مدت50سالپس از این کشف،حدود4000 نوعآنتی‌بیوتیک دیگر شناسایی‌ شدهکهمنشاءآن‌ها باکتری‌هایگروهاکتینومیست‌ها هستند (2009 ,Dehnad). اگرچه مقدار جداسازی ترکیبات از پیش شناخته شده از اکتینومیست‌ها افزایش یافته است اما با بکارگیری روش‌های نوین جداسازی و نیز غربالگری سویه‌های مولد از مناطقی که کمتر بررسی شده‌اند و از طرفی غربالگری تعداد نمونه‌های بالا تاحدی می‌توان بر این محدویت غلبه کرد. 1-5-1- ویژگی‌ اکتینومیست‌ها اکتینومیست‌ها باکتری‌هایی با رشد آهسته، دارای رشته‌های منشعب مثل قارچ و دارای کلنی‌های میسلیومی می‌باشند. مدت زمان طولانی به عنوان قارچ در نظر گرفته می‌شدند در حالی که ویژگی‌های پروکاریوت‌های حقیقی را دارا می‌باشند. اکتینومیست‌ها گرم مثبت، هتروتروف، میله‌ای شکل، هوازی، غیر متحرک، رشته ای منشعب و دارای اسپور غیر جنسی هستند. درصد C+G اغلب گونه‌های آن بیشتر از بقیه باکتری‌ها و حدود 78-63% می‌باشد. باکتری‌ها هنگام رشد بر روی محیط آگاردار کلنی‌های نرم، لزج و بی‌رنگ یا رنگ‌های مختلف تولید می‌کنند ولی اکتینومیست‌ها ایجاد کلنی‌های سخت و تحت فشار به صورت پودری می‌کنند. این باکتری‌ها هوازی اجباری هستند. اکتینومیست‌ها دارای اهمیت تجاری و اقتصادی به لحاظ تولید آنتی بیوتیک‌های صنعتی بوده و نقش مهمی در تجزیه پلیمر‌های آلی طبیعی مقاوم به تجزیه بر عهده دارند. این باکتری‌ها بخاطر تولید متابولیت‌های فعال زیستی در فرایند‌های بیولوژیکی سودمند می‌باشند (Goodfellow, 1984). تا به امروز اکتینومیست‌ها غنی‌ترین منبع برای محصولات طبیعی مهم از لحاظ بیوتکنولوژی از جمله تولید آنتی بیوتیک‌ها می‌باشند. 1-5-2- مورفولوژی اکتینومیست‌ها آرایش میسلیوم‌ها و تشکیل اسپور در اکتینومیست‌ها، از لحاظ فیلوژنی و تاکسونومی حائز اهمیت است. اغلب جنس‌های اکتینومیست تشکیل اسپور می‌دهند. تفاوت در شکل و آرایش میسلیوم‌های هوایی و ساختار‌های حامل اسپور در جنس‌های مختلف از جمله جنبه‌های اساسی در افتراق جنس‌ها در یک گروه خاص است. اکتینومیست‌ها دو نوع تقسیم سلولی دارند. تکثیر از طریق جداشدن قطعات میسیلیوم با اشکال مختلف یا از طریق تشکیل اسپور است. در حالت اول در طول رشد رویشی تقسیمات سلولی به ندرت سبب تشکیل دیواره عرضی می‌شود و هیف‌ها را به قطعات چند نوکلئوتیدی بزرگ تقسیم می‌کند. در حالت دوم تقسیم‌های سلولی همزمان در هیف‌های هوایی سبب تشکیل اسپورهای جدا ازنظر فیزیکی می‌شود(Van Wezel, 2006). رشد در انتهای رشته‌ها اتفاق می‌افتد و اغلب با منشعب شدن همراه است. در این میکروارگانیسم‌ها شکل لوله‌ای اولیه به صورت یک رشته‌ی بلند افزایش طول پیدا می‌کند. در برخی گونه‌ها به صورت متناوب دارای شاخه می‌شود و حتی در برخی دیگر در جهات بسیاری گسترش می‌یابد. برخی گونه‌ها همچنین دیواره عرضی ایجاد می‌کند که رشته را به قطعات مجزا تقسیم می‌کند. مرحله رویشی در اکتینومیست‌ها متشکل از یک زمینه سخت، بهم بافته‌شده و پیچیده است که میسلیوم‌ها درهم پیچیده و فشرده و در نهایت تشکیل کلنی می‌دهند. با افزایش سن کلنی‌ها رشته‌های هوایی ویژه‌ای به نام اسپوروفور تشکیل می‌دهند که از سطح کلنی‌ها بیرون می‌زنند و اسپور را تشکیل می‌دهند. میسلیوم‌های هوایی ممکن است فراوان بوده و به سطح کلنی ظاهر کرکی، مخملی و یا پودری بدهد. از طرفی ممکن است به طور ضعیف رشد کنند و دسته‌هایی پراکنده از رشته‌های واقع بر سطح کلنی را تشکیل بدهند. هیف‌های هوایی کنیدی و کنیدیوسپور را حمل می‌کنند. اسپور‌های اکتینومیست‌ها از اندوسپور‌های سایر باکتری‌ها مثل باسیلوس وکلستریدیوم متفاوت است زیرا به‌سادگی از طریق تشکیل دیواره عرضی در اسپوروفورهای چند هسته‌ای و به دنبال آن جداشدن سلول‌های منفرد تشکیل می‌شود. اسپوروفور بسیاری از گونه‌های اکتینومیست‌ دارای پیگمان بوده و رنگ ویژه‌ به کلنی می‌دهد. اسپورهای اکتینومیست‌ها اغلب بیضوی یا کروی شکل با انتهای تیز می‌باشند. شیوه‌ی تشکیل اسپور متفاوت بوده و برای جداکردن زیرگروه‌ها استفاده می‌شود. اسپور‌ها با دو روش یکی جداشدن و دیگری قطعه قطعه‌شدن تشکیل می‌شوند. در حالت اول شاخه تشکیل‌دهنده اسپور از طریق دیواره عرضی به سلول های جداگانه تفکیک و اسپور‌های بالغ تشکیل می‌شود. در حالت دوم پروتوپلاست اسپورانژیوم به بخش‌های جدا و یا توده‌های بدون تشکیل دیواره تقسیم می‌شوند. توده‌ها در انتها کروی شده و با غشا خود پوشیده و تبدیل به اسپورهای بالغ می شوند. رشد هوایی همراه با تغیرات در سطح هیف است. سطح میسلیوم زمینی آبدوست است در حالی که سطح میسلیوم هوایی آبگریز می‌باشد. تنظیم تشکیل هیف‌های هوایی فرآیندی پیچیده است. دسته‌ی ژنی bld نقاطی را در بیان ژن‌ها کنترل می‌کند که منجر به آغاز رشد هوایی می‌شود، این عمل از طریق تشکیل مولکول‌های فعال سطحی که کشش سطحی آب را کاهش می‌دهند صورت می‌گیرد (Willey et.al, 2008). در توسعه‌ی هیف‌های هوایی ژن‌های Whi دخالت دارند که تشکیل اسپور را کنترل می‌کنند. اسپور‌ها معمولا در شرایط کمبود مواد غذایی تشکیل می‌شوند. اسپور در اکتینومیست‌ها به حرارت مقاوم است Chater, 2001)). 1-5-3- فیزیولوژی اکتینومیست‌ها اغلب اکتینومیست‌ها شیمیوارگانوتروف، هوازی، مزوفیل و دارای رشد بهینه در pH نزدیک به خنثی می‌باشند. اکتینومیست‌ها در خاک معمولا با تشکیل میسلیوم رویشی و به صورت رشته‌ای منشعب رشد می‌کنند. این ویژگی رشد با فعالیت آنزیم‌های هیدرولازی خارج سلولی فراوان در ارتباط است. این آنزیم‌ها دسترسی به مواد غذایی محصور شده در پلیمر‌های خاک را ممکن می‌سازد. هنگامی که میسلیوم رویشی با محدودیت مواد غذایی مواجه می‌شود دو ویژگی مهم را بروز می‌دهد. یکی تولید آنتی‌بیوتیک و متابولیت‌های ثانویه و دیگری تشکیل انشعابات هوایی زاینده. اکتینومیست‌های خاکی نسبت به بقیه باکتری‌های خاک به آب فعال[28] (wa) کمتری برای رشد نیاز دارند. اسپور اکتینومیست‌ها به خشکی مقاوم است و تا 7500 سال توانایی زنده ماندن را دارد (Goodfellow, 1984). اکتینومیست‌ها از نظر تغذیه‌ای انعطاف پذیر می‌باشند و توانایی تجزیه طیف وسیعی از مواد آلی را دارند و از طرفی می‌توانند به صورت هوازی مواد مقاوم به تجزیه از جمله پکتین، لیگنین، کیتین، کراتین را تجزیه کنند. بسیاری از اکتینومیست‌ها بوی ویژه‌ای شبیه بوی زمین مرطوب (ژئوسمین[29]) را دارند. اکتینومیست ها در معدنی کردن ترکیبات آلی خاک و چرخه مواد آلی در اکوسیستم خاک نقش دارند. در میان محصولات متابولیکی اکتینومیست‌ها ترکیبات فعال زیستی ازجمله آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد سمی دیده می‌شوند. از جمله مواد زیستی ویتامین B1،B2،B12،B6 و اوکسین‌ها[30] را می‌توان نام برد. اکتینومیست‌ها توانایی سنتز رنگدانه‌‌های متنوع را دارند که برخی می‌تواند در محیط رشد انتشار پیدا کند (Watve, 2001). 1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها اکتینومیست‌ها گسترش زیادی در زیستگاه‌های مختلف خشکی و آبی دارند و در محیط‌های خشکی از اجزای اصلی میکروارگانیسم‌های خاک می‌باشند. گسترش اکتینومیست‌ها به موقعیت جغرافیایی، دمای خاک، نوع خاک، مواد آلی، فعالیت‌های کشاورزی، هوادهی و رطوبت خاک وابسته است. بیشتر جمعیت اکتینومیست‌ها در لایه‌های سطحی بوده که با افزایش عمق از تعداد آنها کاسته می‌شود. اکتینومیست‌ها در خاک‌های قلیایی غنی از مواد آلی، تولید متابولیت‌های ثانویه دارند که در داروسازی و کشاورزی نقش دارند(Arifuzzaman, 2010). 1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها بر اساس مطالعات به نظر می‌رسد آخرین جد مشترک اکتینوباکترها که از آن منشآ گرفته‌اند به حدود2-1.5 میلیارد سال قبل، زمانی که اولین بار اتمسفر زمین دارای اکسیژن شد، بر می‌گردد (Embley, 1994). این باور وجود دارد که اکتینومیست‌ها حدود 440 میلیون سال قبل بلافاصله پس از ظهور گیاهان سبز روی زمین و همزمان با افزایش میزان اکسیژن، اشتقاق یافته‌اند (Heckman et al. 2001). این امر نشان دهنده پتانسیل سازگاری این باکتری‌ها در استفاده از بقایای گیاهی سخت تجزیه‌پذیر می‌باشند. این باکتری‌ها دارای ژن‌های مختلف و مکانیسم‌های متنوع در مقابله با استرس اکسیداتیوهستند(Schaal, 1992). اکتینومیست‌ها متعلق به راسته Actinomycetales بوده و در سلسله Bacteria، شاخه Actinobacteria، رده‌ی Actinobacteria، زیررده‌ی Actinobacteriadea و راسته Actinomycetales قرار دارند و شامل 10 زیر راسته، 38 خانواده و 123جنس است (Willey, 2008؛Zhi et al., 2009). اکتینومیست‌ها شامل زیر راسته‌های (Euzéby, 1997): Actinomycineae, Actinopolysporineae, Catenulisporineae, Corynebacterineae, Frankineae, Glycomycineae, Jiangellineae, Kineosporineae, Micrococineae, Micromonosporineae,‌Propionibacterineae,Pseudonocardineae, Streptomycineae and Streptosporangineae. از معیار‌های شناسایی سودمند برای اکتینومیست‌ها شناسایی ترکیبات شیمیایی دیواره سلولی، الگوی مونوساکارید‌های دیواره سلولی، الگوی اسیدهای چرب، نوع فسفولیپیدهای غشا و درصد مولی C+G می‌باشد (Goodfellow, 1984). در میان اکتینوباکتر‌های آزادزی درصد سیتوزین و گوانین از 54% در برخی کورینه‌باکتریوم‌ها تا بیش از 70% در برخی اکتینومیست‌ها متفاوت است. روش‌های مولکولی مفید در شناسایی این باکتری‌ها شامل 16S rRNA و هیبریدسازی DNA-DNA می‌باشد. 1-5-6- متابولیت‌های ثانویه متابولیت‌های ثانویه تولید شده توسط اکتینومیست‌ها دارای تنوع ساختاری زیاد و ساختار پیچیده می‌باشند. متابولیت‌های ثانویه ترکیباتی هستند که نقش شناخته‌شده‌ای در مکانیسم‌های داخلی ارگانیسم تولید کننده ندارند و به ندرت در مسیر‌های معمول فیزیولوژی سلول دخالت می‌کنند در حالی که متابولیت‌های اولیه به طور کامل در ساختار فیزیولوژیکی سلول موثر‌اند (شکل 1-1). مسیر‌های بیوشیمیایی متابولیت‌های ثانویه از مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های اولیه منشعب می‌شوند. علیرغم تشابه مولکول‌های حدواسط مسیرهای بیوسنتزی، محصولات نهایی متابولیت‌های ثانویه متنوع‌تر می‌باشد. علت آن متنوع بودن مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه که باعث بوجود آمدن انشعابات متعدد در مسیر‌های بیوسنتزی متابولیت‌های اولیه است. با توجه به تنوع ژنتیکی سنتز متابولیت‌های ثانویه، تغییر شرایط محیطی می‌تواند سبب بیان ژن‌های مختلف و درنتیجه تولید متابولیت‌های ثانویه جدید شود (Debabov, 1995). شکل 1-1. متابولیت‌های اولیه و ثانویه و زمان تشکیل این ترکیبات در نمودار رشد باکتری‌ها (Debabov,1995). 1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال اکتینومیست‌ها به عنوان یک پروفایل از عوامل ضد میکروبی جدید شناخته می‌شوند. طیف گسترده‌ای از اکتینومیست‌ها توانایی تولید متابولیت‌های ثانویه با فعالیت بیولوژیکی را دارند. اکتینومیست‌ها به رشد گیاهان از طریق تثبیت نیتروژن، انحلال پذیر کردن مواد مغذی و تثبیت آنها، کنترل بیولوژیکی و نگهداری ساختار خاک کمک می کنندAtta et al. 2010) ). خصوصیات تاکسونومی آنتی بیوتیک‌های تولید شده توسط اکتینومیست‌ها یک جنبه مهم در غربالگری آنتی بیوتیک‌های جدید می‌باشد(Van hop, 2011). در بین 14 زیر راسته اکتینومیست‌ها مهمترین زیر راسته‌های تولید کننده ترکیبات فعال زیستی شامل: 1)Actinomycineae این زیر راسته دارای شکل نامنظم بوده و میسلیوم‌ها دارای رشته‌های متلاشی و بدون هیف هوایی و اسپور می‌باشند. هوازی و در بعضی گونه‌ها بی‌هوازی می‌باشند. این باکتری ها توانایی تولید آنزیم‌های کیتیناز و پکتیناز می‌باشند که نقش مهمی در تجزیه مواد آلی خاک دارند. اعضای این زیر راسته در شکل‌گیری کمپوست[31] نیز نقش دارند (shi et al, 2011). و شامل جنس‌های زیر می‌باشد: Actinobaculum، Actinomyces، Arcanobacterium، Falcivibrio، Mobiluncus Trueperella، Varibaculum 2)Streptomycineae تنها یک خانواده Streptomycetaceae و 10 جنس دارد که مهمترین آن جنس استرپتومیسس است. باکتری‌ها موجود در این زیر راسته هیف‌های هوایی متشکل از حدود 50 کنیدیوسپور[32] غیر متحرک تولید می‌کند که باعث می‌شود سطح کلنی حالت پودری دیده شود (Willey et al. 2008). این زیر راسته هم در اکولوژی و هم در پزشکی بسیار مهم هستند. زیستگاه طبیعی بیشتر آنها خاک است که حدود 20-1% از جمعیت خاک را تشکیل می‌دهند. بوی خاص زمین مرطوب به خاطر تولید ترکیبات فرار مثل ژئوسمینتوسط استرپتومیسس‌ها می‌باشد (jiang et al. 2007). این باکتری‌ها نقش مهمی در معدنی کردن[33] مواد آلیخاک دارند. از نظر تغذیه‌ای انعطاف پذیر هستند و قادراند ترکیبات مقاوم به تجزیه مثل پکتین، لیگنین، کیتین، کراتین و ترکیبات آروماتیکی را تجزیه کنند(Shi et al. 2011). استرپتومیسس به خاطر تولید طیف وسیعی از آنتی بیوتیک‌ها مثل استرپتومایسین، آمفوتریپسین ب[34]، اریترومایسین، نئومایسین و ... که بیشتر آنها در پزشکی و کشاورزی کاربرد دارد شناخته شده می‌باشد (Watve et al. 2001). 3)Corynebacterineae شامل هفت خانواده و جنس‌های مختلف است که مهمترین آنها نوکاردیا، کورینه باکتریوم و مایکوباکتریوم است. این زیر راسته شامل باکتری‌های هوازی، کاتالاز مثبت و میله‌ای شکل یا رشته‌ای هستند. دیواره سلولی آن‌ها غیر معمول بوده و دارای پپتید و گلیکان همراه با مزودی‌آمینوپالمیک اسید[35] و دارای اسیدهای میکولیک می‌باشند (Van hop, 2011). این باکتری‌ها با تولید آنزیم‌های تجزیه کننده، نقش مهمی در حذف زیستی محیط‌های آلوده به ترکیبات نفتی به علت توانایی استفاده از سوبستراهای گوناگون را دارند. برخی جنس‌ها مثل ردوکوکوس[36] و مایکوباکتریوم[37] نقش مهمی در معدنی کردن حلقه‌های آروماتیک هیدروکربن‌ها دارند. آنتی‌بیوتیک گریزوزین[38] از این زیر راسته جداشده است(Uyttebroek, 2006). 4)Micrococcineae این زیر راسته شامل 17 خانواده و جنس‌های گسترده می‌باشدکه مهمترین جنس‌های آن میکروکوکوس[39] و آرتروباکتر[40] است. این زیر راسته شامل باکتری‌های هوازی، کاتالاز مثبت، کوکسی تا میله‌ای و بدون تحرک می‌باشد. به طور گسترده در خاک، آب و پوست جانوران دیده می‌شوند. یک ویژگی غیر معمول این زیر راسته انعطاف پذیری در مصرف مواد از جمله علف کش‌ها و آفت کش‌ها به خاطر تولید آنزیم‌های فعال، می‌باشد (Shi et al.2011). 5)Micromonosporineae تنها یک خانواده میکرومونوسپوراسه[41] و 30 جنس دارد. این باکتری‌ها هوازی، دارای میسلیوم‌های بستر گسترده، هیف‌ها رنگی بوده و تولید پیگمان محلول می‌کنند. هر دونوع اسپور متحرک و غیر متحرک در این زیر راسته دیده می‌شود. به طور گسترده در طبیعت پخش شده‌اند. به علت تولید آنزیم‌های هیدرولیتیک مثل گزیلاناز[42] و کیتیناز[43] توانایی تجزیه طیف وسیعی از ترکیبات آلی را در طبیعت دارند. اعضای این زیر راسته در تثبیت نیتروژن خاک نیز نقش دارند(Hirsch, 2010). آنتی بیوتیک جنتامایسین[44] توسط جنس میکرومونوسپورا در این زیر راسته تولید می‌شود (Willey, 2008). 1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست حدود 23000 متابولیت ثانویه فعال توسط میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شود و اکتینومیست‌ها بیش از 10000 نوع آنتی‌بیوتیک و ترکیبات ضد میکروبی مختلف تولید می‌کنند که به عنوان منبع ترکیبات فعال و ترکیبات جدید شناخته می‌شوند (Dehnad, 2009). حدود 130 تا 140 متابولیت میکروبی و تعداد مشابهی از مشتقات این ترکیبات در پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد که غالب این ترکیبات به جز پنی‌سیلین‌ها و سفالوسپورین‌ها و برخی پپتید‌های باکتریایی از محصولات اکتینومیست‌ها هستند درصد بالایی از ترکیبات مشتق شده ار غربالگری‌های صورت گرفته با کمک اهداف مولکولی جدید برای رسیدن به ترکیبات ضدمیکروبی جدید نیز روی اکتینومیست‌ها انجام شده است(Moncheva et. a,l 2001 ) . 1-5-8- اهمیت استرپتومیسس‌ها استرپتومایسس‌هادرراستهباکتریایی اکتینومیست‌ها قرار دارند. این باکتری‌ها گرممثبت،بدونحرکتورشته‌ای،تولیدکنندهاسپور خارجی،هوازیوشیمیوارگانوتروفقرار دارند. اینباکتری‌هادرساختاررشته‌ایخودشبیه بهقارچ‌هاهستند. کلونی‌استرپتومایسسباظاهرگچیوبویشبیه به بوی خاک خود قابل تمایزاند . این باکتری‌ها به طور وسیعی در طبیعت پراکنده‌اند و بویژه در خاک، زیست کرده و تجزیه کننده‌های بسیار مهمی هستند. در حدود 500 گونه شناخته شده از این جنس وجود دارد که بسیاری از آنها مهم ترین تولید کننده‌های صنعتی آنتی بیوتیک‌ها و دیگر متابولیت‌های ثانویه ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدویروسی ، ضدسرطانی ، ضدتوموری، ایمونوساپرسنت[45] و آنتی هیپرکلسترولومیکس هستند (Kieser, 2000).گونه‌های باکتری استرپتومایسس از نظر متابولیکی قادرند بسیاری از ترکیبات متفاوت شامل قندها ، الکل‌ها، آمینواسیدها و ترکیبات حلقوی را توسط آنزیم‌های هیدرولیتیک متابولیزه کنند (Cross, 1989). استرپتومایسسهابهخاطرتواناییتولیدوسنتزآنتیبیوتیک هموارهموردتوجهبودهاند. این آنتیبیوتیکهابهباکتریکمکمیکنندکهدرشرایطکمبود موادغذاییمحیطیبادیگرمیکروارگانیسم‌هایخاکرقابت کنند. اینرقابتباممانعتازرشدمیکروارگانیسم‌هایدیگر همراهاست . بسیاریازاینآنتیبیوتیک‌هامنحصراسنتز پروتئینراتحتتأثیرقرارمی‌دهندوبهاینترتیبازرشد میکروارگانیسمممانعتمی‌کنند. استرپتومایس‌ها،‌ مهمترین اکتینومیست تولید کننده متابولیت‌های ثانویه می‌باشد. اینمتابولیت‌های ثانویهتنوعوسیعیراازنظرساختارهایشیمیایینشان می‌دهند که این ساختارهای شیمیایی شامل گروه‌های آمینوگلیکوزیدی[46] (آمینوسیکلیتول)، آنسامایسین[47]، بتالاکتام‌ها[48]، ماکرولیدها[49]، نوکلئوزیدها[50]، پپتیدها و پلیان‌ها،تتراسایکلینهاودیگرآنتیبیوتیک‌های خارج ازاین گروه‌های تعریفشده می‌باشند. با تحقیقات جدیدی که برروی تعیین توالی ژنوم استرپتومایسس اسکابیس[51] انجام شدهبه نظر می‌رسد که امکان اشتقاق آنتی بیوتک‌‌های بیشترنیز که تاکنون کشفنشده اند وجود دارد. پروژه‌های استفاده از داده‌های ژنومی در سنتز آنتی بیوتیک‌هایجدیداکنون در حال اجرا می‌باشند. در حال حاضر مطالعات بر روی امکان استفاده از مهندسی ژنتیکبهمنظور ایجاد مواد شیمیایی کاملاجدید از طریق پیرایش متفاوت mRNAهای تولید‌شده توسط باکتریمتمرکز شده‌اند. تحقیق و مطالعه بر روی آنتی بیوتیک‌های جدیدو سایرمتابولیت‌هایمبکروبیمؤثردرفعالیت‌های زیستیبهدلیلدارابودن پتانسیل استفاده در کشاورزی، مصارف دارویی و کابردهای صنعتی، پیوسته رو بهافزایش می‌باشد (2003Takahashi,). در این میانباکتری‌های جنس استرپتومایسس همچنان بهعنوان یکی از منابع اصلی تولیدکننده متابولیت‌های جدید زیستیمورد توجه هستند(غربالگری اذربایجان دهناد88). 1-5-9- اکتینومیست‌های دریایی اکتینومیست‌ها تقریبا 10 درصد از جمعیت باکتریایی رسوبات بستر دریا را‌ تشکیل می‌دهند. میکروارگانیسم‌های زیستگاه‌های دریایی به عنوان منابع شگفت انگیز تولید مواد بیواکتیو قوی بشمار می‌روند(Safaeian, 2005). اکتینومیست‌های دریایی که خود را با شرایط خاص دریا از قبیل شوری و میزان کم مواد آلی وفق داده‌اند در نتیجه با همتایان خاکی خود دارای تفاوت می‌باشند در نتیجه می‌توانند منبع تولید ترکیبات جدید با خواص بیولوژیک باشند(Takizawa, 1993; lin and liu, 2010; Jianyou, 2011). توجه و تحقیق روی میکروارگانیسم‌های دریایی توسط اوکامی[52] 1976، جنسن[53]و فینیکال[54] 1994 آغاز شد. درسال‌هایاخیربه دلیلنیازبهمحصولات فعال بیولوژیکیجدید، با میکروارگانیسم‌هایدریایی بهعنوانمنبعجدیدباپتانسیل تولیدمتابولیت‌هایمنحصر بهفرد،موردتوجهقرارگرفته‌اند (Kumar, 2011). مطالعه روی اکتینومیست‌های رسوبات دریایی برای جداسازی سویه‌های جدید با توانایی تولید ترکیبات ضد میکروبی، ارزشمند است (Sharma, 2010). در مورد اکتینومیست‌های دریایی گزارش کمی در دسترس است. (Das, 2010).امروزه میکروارگانیسم‌های دریایی به عنوان منبع بکر و دست نخورده از ترکیبات فعال بیولوژیک با ساختارهای جدید شیمیایی به شمار می‌روند. در نیم قرن گذشته اکثر آنتی‌بیوتیک‌ها و داروهای ضد توموری جدید از اکتینومیست‌های خاکی بدست‌آمده‌اند. با این حال اکتشافات و نوآوری‌های داروهای جدید از اکتینومیست‌های خاکی در سال‌های اخیر کاهش پیدا کرده‌است. به همین دلیل اکتینومیست‌های دریایی توجه محققان را به‌خود جلب کرده‌اندMaldonado et al., 2005) ;Ward and Bora, 2006; Anzai et al., 2008). آمار نشان می‌دهد تعداد ترکیبات جدید جداشده از اکتینومیست‌های دریایی در قرن 21 نسبت به قرن گذشته بیش از دو برابر شده است. نتایج تحقیقات نشان داده است که اکتینومیست‌های دریایی میتواند تبدیل به یکی از منابع مهم میکروارگانیسم‌ها در صنایع دارویی به شمار روند(Berdy, 2005). از برخی از اکتینومیست‌های دریایی تعدادی مولکول فعال زیستی با خاصیت ضد میکروبی و ضد توموری کشف شده‌اندMaskey et al., 2004; Manam, 2005)). این متابولیت‌های جدید اکتینومیست های دریایی را به عنوان روشی برای حفاظت از محصولات کشاورزی و توسعه دارو معرفی می‌کند (Zhao et al., 2009). همچنین گزارش‌هایی از استفاده از اکتینومیست‌های دریایی به عنوان پروبیوتیک در آبزی پروری وجود دارد. آغاز غربالگری اکتینومیست‌های دریایی برای استفاده به عنوان عوامل بیوکنترلی جدید برای حیوانات آبزی از سال 2008 شروع شد. در این بین استرپتومیسس‌های دریایی جایگاه ویژه‌ای دارند. بنابراین، استرپتومایسس می تواند به عنوان عوامل کنترل بیولوژیکی بالقوه در آبزی پروری استفاده شوند. با این حال، برای ایجاد یک ماهیت پروبیوتیک استرپتومایسس برای پیشگیری از بیماری یا محرک رشد آبزی پروری حیوانات، مطالعات گسترده و تجزیه و تحلیل هزینه‌ها و سود لازم است (Das, 2010). 1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی قارچ‌های پاتوژن عامل بروز بسیاری از بیماری‌ها مثل کچلی، مسمومیت غذایی، بیماری‌های گیاهی بوده و باعث بروز مشکلات جدی در سراسر جهان شده‌اند. برخی گونه‌های قارچ نظیر Claviceps purpurea تولید مایکوتوکسین می‌کند که برای انسان بسیار سمی است (Sharma, 2010). امروزهشماربیمارانیکهازبیماری‌هایقارچیبه خصوص عفونت‌های فرصت طلب در مبتلایان به نقص سیستم ایمنی، رنجمی‌برند روبهافزایش است.از طرفی قارچ‌ها ماهیتیوکاریوتیدارند و یافتنداروهایضدقارچیباسمیت انتخابی برمیزبانآساننیست (Shadzi, 2009). لذا نیاز به داروهای ضد قارچی جدید و موثر به یک چالش عمده، در صنعت داروسازی تبدیل شده است. اغلب داروهایضدقارچیمورد استفادهدرپزشکی، دارایاثراتجانبیهستند وشمار زیادیازترکیبات ضدقارچی تولید شدهتوسط میکروارگانیسم‌ها،دارایاثراتسمیبرایانسانهستند .امروزهتعداد کمیازداروهایضدقارچیمورداستفاده،از گونه‌هایاکتینومیستبه ویژهجنس استرپتومیسس استخراج شده‌اند. ازمهم‌ترینآن‌هانیستاتین[55]، آمفوتریسین B[56] و پیمارسین[57]می‌باشد(Abdi Soofiani, 2011). مطالعات گسترده برایبدستآوردنآنتی‌بیوتیک‌هایجدیداز اکتینومیست‌هابااثراتبهتروسمیت کمتربرمیزبان،ادامه دارد (Henkel, 1991). با این حال توجه کمی به جداسازی اکتینومیست‌های دریایی با خاصیت ضد قارچی، شده است. 1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید تحقیقات دریایی روی میکروارگانیسم‌ها و سایر جانوران مانند نرم تنان، اسفنج ها و باکتری ها در طول سال‌های گذشته، ترکیبات دارویی جالب زیادی به ویژه در گروه داروهای ضد سرطان به همراه داشت( Molinski,2008). میکروارگانیسم‌های دریایی به وضوح نشان دهنده یک منبع غنی برای مولکول های فعال زیستی جدید می‌باشند (Blunt, 2007)، با این حال فراوانی پایین تولیدات طبیعی و یا غلظت کم تولیدات میکروارگانیسم‌های دریایی به عنوان مشکل در نظر گرفته می‌شود. باکتری‌های مولد ترکیبات ضدمیکروبی دریایی از گروه سیانو باکتری‌ها و اکتینومیست‌ها می‌باشند. اولین اکتینومیست دریاییRhodococcus marinonascens در سال 1984کشف شد و در سال 2005 Salinispora اولین اکتینومیست دریایی وابسته به آب دریا، ، گزارش شد (Maldonado, 2005). در میان انواع تولیدات جدید مشتق شده از اکتینومیست‌های دریایی ترکیبات بیولوژیکی با فعالیت ضد سرطان و ضد باکتری بیشتر بوده است. برای مثال گوتینجیمایسین[58]بوناستین[59]هیمالومایسین[60] و لاجولامایسین[61] ترکیبات تولید شده توسط گونه‌های استرپتومایسس دریایی با فعالیت ضد باکتری و ترکیباتی مثل کاپرولاکتون‌ها[62]، چینیکومایسین[63] و سالینوسپورامید[64] از جمله ترکیبات ضد سرطان تولید شده توسط اکتینومیست‌های دریایی است (جدول 1-2) (Lam, 2006). جدول 1-2- . ترکیبات جدید کشف شده از اکتینومیست‌های دریایی (Lam, 2006) 1-6- اهداف پژوهش مطالعات گسترده برایبدستآوردنآنتی‌بیوتیک‌هایجدیداز اکتینومیست‌هابااثراتبهتروسمیت کمتربرمیزبان،ادامه دارد. با این حال توجه کمی به جداسازی اکتینومیست‌های دریایی با خاصیت ضد میکروبی، شده است. از طرفی مطالعه روی اکتینومیست‌های رسوبات دریایی برای جداسازی سویه‌های جدید با توانایی تولید ترکیبات ضد میکروبی، ارزشمند است. در کشور ما نیز مطالعات زیادی برای جداسازی اکتینومیست‌ها با فعالیت ضد میکروبی از مناطق مختلف گزارش شده است. اما تاکنون هیچ مطالعه‌ای روی اکتینومیست‌های بستر دریای مازندران صورت نگرفته است. در اینتحقیق برای اولین بار، اکتینومیست‌های فعال تولید کننده ترکیبات ضد میکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران، جداسازی و موردشناساییقرارگرفته است. اهداف پژوهش حال حاضر شامل: 1-جداسازی و کشت اکتینومیست‌ها از رسوبات بستر دریای مازندران 2-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی با روش CrossStreak 3-بررسی ویژگی‌های مورفولوژیکی و میکروسکوپی جدایه‌های فعالو استخراج متابولیت‌های فعال از آن‌ها 4-غربالگری ثانویه سویه‌های فعال با روش دیسک دیفیوژن 5-بررسی اثر ضد قارچی عصاره خام جدایه‌های فعال 6-بررسی فعالیت متابولیت‌های تولید شده توسط سویه‌های فعال روی استافیلوکوکوس‌های مقاوم به آنتی بیوتیک(MRSA) 7-بررسی اثر سینرژیسمی متابولیت‌های تولیدشده توسط سویه‌های فعال با آنتی بیوتیک تتراسایکلین 8-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال بررسی مولکولی ژن16SrDNAسویه‌هایفعالو تعین توالی آن [1]. Santonin [2]. Cinchona [3]. Paul Ehrlich [4]. Arsphenamine [5]. Antibiosis [6].Vilmain [7]. Antagonism [8]. Louis Pasteur [9]. Robert Koch [10]. Allexander Fllemiing [11]. Staphylococcus [12]. Penicillium [13]. Florey [14]. Chain [15]. Penicllium notatum [16]. Gramicidin [17]. Bacillus bervis [18]. Streptomycin [19]. Streptomyces [20]. Waksman [21]. Cidal [22]. Static [23]. Clustered [24]. Doripenem [25]. Additive [26]. Streptomyces [27]. Waksman [28]. Water active [29] .Griseusin [30]. Oxine [31]. Compost [32]. Conidiospores [33]. Mineralization [34]. Amphotericin B [35]. Mso-diaminopimelic acid [36]. Rhodococcus [37]. Mycobacterium [39]. Micrococcus [40]. Arthrobacter [41]. Micromonosporaceae [42]. Xylanases [43]. Chitinases [44]. Gentamicin [45] .Immunosuppressant [46]. Aminoglycosides [47]. Ansamycins [48]. β-lactam [49]. Macrolide [50]. Nucleoside [51]. Streptomyces scabies [52]. Okami [53]. Jensen [54]. Finical [55]. Nystatin [56] Amphotericin b [57]. Pimaricin [58]. Gutingimycin [59] . Bonactin [60]. Himalomycins [61]. Lajollamycin [62]Caprolactones [63]. Chinikomycins [64]. Salinosporamide A دریافت فایل جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ ترکیبات ضدمیکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران