دانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایلدانلود فایل
بزرگترین مرجع دانلود فایل(HEAT TRANSFER (HOLMAN
 (HEAT TRANSFER (HOLMANنام کتاب :(HEAT TRANSFER (HOLMAN نویسنده:J.P.HOLMAN ویرایش 6 تعداد صفحه:702 زبان :انگلیسی
|
کتا ب صوتی هیچ چیز جاودانه نیست
 کتا ب صوتی هیچ چیز جاودانه نیستهیچ چیز جاودانه نیستنویسنده: سیدنی شلدون
مترجم: فریده مهدوی دامغانی
داستان درباره سه پزشک زن است. دکتر پیچ تیلور جراح قلب متهم به قتل
بیماری که از او یک میلیون دلار به ارث برده است. دکتر کیث ترنر سیاه‌پوست،
بسیار خوش‌اندام و از مردان فراری. دکتر هانی تافت ا زخانواده‌ای سرشناس
پر از راز و رمز. آنها به مدت پنج سال در بیمارستان امبارکادر در
سانفرانسیسکو کار می‌کردند و با هم همخانه بودند. داستان در دادگاه و
بیمارستان می‌گذرد. زمانیکه پیج در دادگاه برای نجات زندگی خود می‌جنگد،
داستان به عقب بازمی‌گردد و رازها گشوده می‌شوند. داستانی خواندنی
هیجان‌آور همراه با رمز و راز تا حدی عاشقانه همراه با کلی اصطلاحات پزشکی
...
سیدنی شلدون (به انگلیسی: Sidney Sheldon فوریه ۱۹۱۷ - ۳۰ ژانویه ۲۰۰۷) رمان‌نویس معروف آمریکایی بود. شلدون پیش از روی‌آوردن به رمان‌نویسی، فیلمنامه‌ها و نمایشنامه‌هایی نوشت که او را برنده جایزه‌هایی همچون اسکار بهترین فیلمنامهنویسی و جایزه نمایشنامه‌نویسی تونی کردند. او در رمان‌نویسی بسیار موفق بود و در مدتی کوتاه تبدیل به یکی از پرفروش ترین و معروف ترین نویسندگان داستان‌های مردم‌پسند جهان شد. او افزون بر انتشار بیش از ۳۰ فیلم‌نامه، ۲۵۰ فیلم‌نامه تلویزیونی، ۱۰ نمایشنامه و ۱۸ رمان نوشت.آثار شلدون در بیشتر کشورهای دنیا منتشر شده و عنوان نویسنده‌ای را که رمان‌هایش بیشترین ترجمه جهانی را داشته، به‌دست آورد. ناشر آثارش، برآورد کرده‌است که تا زمان مرگ شلدون ۲۷۵ میلیون نسخه از کتاب‌های او در بازار کتاب دنیا مورد خرید و فروش قرار گرفته‌است. زندگی‌نامه شلدون در سال ۱۹۱۷ در شیکاگو زاده شد. والدین‌اش هر دو کم‌سواد بودند. او در ۱۷ سالگی به اجبار به لس‌آنجلس رفت و در استودیوی فیلم‌سازی یونیورسال به کار مشغول شد. شلدون در دهه ۱۹۳۰ برای کمک به خانواده‌اش، مشاغلی مانند گویندگی تئاتر، فروشندگی کفش و حتی گارسونی در رستوران را تجربه کرد. او تحصیل در دانشگاه نورثوسترن را نیمه‌تمام رها کرد و در جریان جنگ جهانی دوم در نیروی هوایی آمریکا خدمت کرد و در پایان جنگ در استودیوی فاکس قرن بیستم به‌عنوان فیلم‌نامه‌نویس مشغول به‌کار شد. او در سال ۱۹۵۱ ازدواج کرد. او همسر اول خود را در سال ۱۹۸۵ از دست داد و در سال ۱۹۸۹ برای بار دوم ازدواج کرد.شلدون سرانجام در بیمارستانی در نزدیکی پالم اسپرینگز کالیفرنیا در اثر ذات‌الریه درگذشت. حرفه شلدون در سال ۱۹۴۷ به‌خاطر نوشتن مرد مجرد و بابی بوکسور جایزه اسکار بهترین فیلمنامهنویسی را به‌دست آورد. شلدون با نوشتن فیلم‌نامه‌های دیگری همچون رژه عید پاک به شهرت دست یافت. در سال ۱۹۵۹ با نوشتن نمایشنامه تلویزیونی سرخ‌موی برادوی، جایزه تونی را کسب کرد. پس از آن نگارش نمایشنامه‌هایی دیگر برای تئاتر برادوی، بر شهرت‌اش افزود. شلدون در سال ۱۹۷۰ و در سن ۵۲ سالگی نخستین رمان خود به نام صورت عریان را انتشار داد. این رمان جایزه ادگار آلن پو را برای او به‌همراه داشت. رمان بعدی او، آن سوی نیمه شب (۱۹۷۴) موقعیت او را به‌عنوان یک نویسنده آثار پرفروش تثبیت کرد.تاکنون بیش از نیمی از رمان‌های شلدون مورد اقتباس فیلم‌های سینمایی و تلویزیونی قرار گرفته‌اند. |
جداسازی و شناسایی باکتریهای تجزیه‌کننده‌ی ترکیبات آروماتیک خلیج فارس، منطقه ساحلی استان بوشهر
 جداسازی و شناسایی باکتریهای تجزیه‌کننده‌ی ترکیبات آروماتیک خلیج فارس، منطقه ساحلی استان بوشهرفهرست مطالب عنوان شماره صفحه 1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق.. 5 فصل دوم:مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق 2-3- نفت و آلودگی‌های نفتی.. 15 2-5- تغییرات نفت پس از ورود به آب دریا.. 17 2-5-2 پخش شدن مواد نفتی در سطح آب.. 18 2-5-5 اکسیداسیون فتوشیمیایی.. 18 2-5-6 بحالت امولسیون در آمدن.. 19 2-7- معرفی هیدروکربنهای آروماتیک.. 20 2-7-1 طبقه‌بندی ترکیبات آروماتیک.. 20 2-7-2 فرمولاسیون ترکیبات آروماتیک.. 21 2-7-3 خواص فیزیکی و شیمیایی.. 22 2-7-4 درجه سمیت ترکیبات آروماتیک.. 23 2-7-5 اثرات هیدروکربنهای پلی‌آروماتیک روی سلامتی انسان‌ها و موجودات زنده.. 27 2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان.. 27 2-7-7 چه عاملی ترکیب را سرطان‌زا میکند؟.. 27 2-8-4 ساختمان مولکولی و خواص فیزیکی.. 29 2-8-6 تأثیر فنل بر محیط زیست و موجودات زنده.. 30 2-9-1 روشهای پاکسازی بیولوژیکی.. 31 2-9-3 میکروارگانیسم‌های هوازی.. 32 2-9-4 میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی.. 32 2-9-6 استفاده از بیوراکتور‌ها.. 33 2-10- میکروارگانیسم های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک.. 35 2-11- مسیر های تجزیه زیستی.. 36 2-11-2 تجزیه میکروبی نفتالین.. 39 3-1- محیط کشت‌های مورد استفاده.. 44 3-1-2 محیط (ONR7a + نفتالین) آگار.. 45 3-1-3 محیط)+ONR7aفنل(آگار.. 45 3-1-4 محیط مارین براث (MB).. 45 3-1-5 محیط مارین آگار (MA).. 46 3-1-6 محیط نوترینت براث (NB).. 46 3-1-7 محیط نوترینت آگار (NA).. 46 3-2-2 محلول اتیلن‌دی‌‌آمینو‌تترا‌استیک‌اسید (EDTA).. 47 3-2-5 محلول EDTA Tris-Base- (TE)48 3-2-6 محلول اتیدیوم بروماید.. 48 3-3- مواد مصرف شده در PCR.. 49 3-4- دستگاه‌های مورد استفاده.. 49 3-5-1 نمونه برداری به منظور جداسازی باکتری های تجزیه کننده 50 3-5-2 شمارش باکتری های موجود در محیط.. 51 3-5-2-1 شمارش باکتری های هتروتروف.. 51 3-5-2-2 شمارش باکتریهای تجزیه‌کننده نفتالین.. 51 3-5-2-3 شمارش باکتریهای تجزیه‌کننده فنل.. 51 3-5-3 جداسازی باکتری های تجزیه کننده.. 51 3-5-3-1 جداسازی و غربالگری باکتری های تجزیه کننده 51 3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتری.. 52 3-5-3-2-2 فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24)52 3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالین.. 52 3-5-4-1 استخراج DNAژنومی با روش فنل کلروفورم.. 53 3-5-4-2 تعیین غلظت DNAاستخراج شده.. 54 3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.. 54 3-5-4-5BLAST کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 55 فصل چهارم:نتایج یافته های تحقیق 4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها.. 58 4-2-2 شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها.. 60 4-3- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین.. 61 4-4- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده.. 62 4-4-1 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7aبه اضافه فنل جهت جداسازی باکتریهای تجزیه‌کننده فنل.. 62 4-4-2 کشت نمونه‌ها در محیط ONR7aبه اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتریهای تجزیه کننده نفتالین.. 62 4-5- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین.. 63 4-5-1 سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین 63 4-5-2 فعالیت امولسیون کنندگی (E24).. 67 4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک.. 71 4-6- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک 75 4-6-2 BLASTکردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها.. 76 4-7- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها.. 92 4-8- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها.. 94 فهرست جداول عنوان شماره صفحه جدول 2-1: 28 ترکیبات آروماتیک به ترتیب میزان سمیت. 23 جدول 3-1: ترکیبات محیط کشت ONR7a. 44 جدول 3-2: ترکیبات محیط کشت مارین براث (MB)45 جدول 3-3: ترکیبات محیط کشت نوترینت براث. 46 جدول 3-4: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47 جدول 3-5: ترکیبات سرم فیزیولوژی. 47 جدول 3-6: توالی و خصوصیات پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی ژن 16 SrRNA.. 49 جدول 3-7: دستگاه های مورد استفاده و مدل آنها. 49 جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در PCR با پرایمرهایAlk 54 جدول 4-1: نامگذاری و معرفی نقاط نمونه گیری بر حسب مشخصات جغرافیایی. 57 جدول 4-2: نتایج شمارش باکتریهای هتروتروف. 59 جدول 4-3: نتایج شمارش کل باکتری های تجزیه کننده. 60 جدول 4-4: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل در طول موج 600 نانومتر. 64 جدول 4-5: نتایج میزان جذب نوری نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین در طول موج 600 نانومتر. 65 جدول 4-6: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده نفتالین 68 جدول 4-7: نتایج تست E24 برای نمونه‌های تجزیه‌کننده فنل. 70 جدول 4-8: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف نفتالین. 72 جدول 4-9: نتایج جذب UV جهت بررسی درصد حذف فنل. 74 جدول 4-10: برنامه رسم درخت فیلوژنی سویه ها. 92 جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله های ژنتیکی سویه ها. 94 جدول 4-12: فاصله ژنتیکی سویه ها. 94 فهرست نمودارها عنوان شماره صفحه نمودار 2-1: مسیر تجزیه میکروبی فنل. 36 نمودار 2-2: مسیر تجزیه میکروبی نفتالین. 39 نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب 73 نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سویه‌های تجزیه‌کننده این ترکیب 74 فهرست شکل ها عنوان شماره صفحه شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن. 21 شکل 2-2: فرمول ساختاری بنزن. 21 شکل 2-3: نمایش موقعیت جانشینی روی حلقه دی متیل بنزن. 21 شکل 2-4: برخی از آروماتیک های چند هسته ای فشرده. 22 شکل 2-5: فرمول تترالین یا تتراهیدرونفتالن. 22 شکل 2-6: مکانیسم های بروز سرطان. 26 شکل 2-7: فرمول ساختاری فنل. 28 شکل 4-1: پوشش کارشناس و نحوه قرار گیری صحیح در حین انجام کار با ترکیبات آروماتیک زیر هود. 62 شکل 4-2: نمونه‌های کشت داده شده در محیط اختصاصی به اضافه فنل و نفتالین. 63 شکل 4-3: نتایج تست E24فعالیت امولسیون کنندگی. 67 شکل 4-5: بررسی محصول PCRبر روی ژل آگارز. 75 شکل 4-6: درخت فیلوژنی نمونه‌ها. 92 شکل 4-7: درخت فیلوژنی نمونه‌های جداسازی شده با مشخص بودن نتایج BLAST.. 93 چکیدهترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آنها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال 2013 بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتریهای تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روشهای کاهش آلاینده‌های مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسمها جهت پاکسازی اینگونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتریهای جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتریهای جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمرهای Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد 9 باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد. کلمات کلیدی: تجزیه میکروبی, ترکیبات آروماتیک, منطقه ساحلی استان بوشهر, خلیج‌فارس, واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR). فصل اول:کلیات تحقیق1-1- مقدمهخلیجفارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژه‌ی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیب‌پذیر است و ورود کمترین آلاینده‌ها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیج‌فارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیج‌فارس محل حمل و نقل جهانی محسوب می‌شود و این امر موجب شده در سال‌های گذشته لکه‌های نفتی بسیاری از این نفت‌کش‌ها در آب‌های خلیج‌فارس به جا بماند, از طرفی آلاینده‌های صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا می‌شوند و همچنین بخشی از آلاینده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتی‌ها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زباله‌ها از داخل شناورها به خلیج‌فارس تزریق می‌شوند. مرجان‌های زیبا و گونه‌های نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلاینده‌ها به درون دریا می‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایسته‌ای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بی‌توجهی‌ها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آنها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه می‌شود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست. بخش اعظم آلاینده‌های موجود در خلیج‌فارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیون‌ها ترکیب تشکیل شده است که در کل میتوان آنها را در 4 دسته تقسیم‌بندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربنهای اشباع, رزین‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقه‌های بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیم‌بندی می‌شوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهربه ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی 9 سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسمها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان نامه از 5 فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق میباشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم. 1-2- بیان مسئلهتجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند(Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری میباشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی میباشد، هیدروکربنهای نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربنهای آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs[1] به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربنهای نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و پخش آلاینده‌ها توسط نیروگاه‌ها و نشت آلاینده‌ها از مخازن نفت و ایستگاه سوختگیری و غیره وارد محیط زیست می‌شوند ((Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46; Cappello and Crisari et al. 2012, 39-50). استفاده از فعالیت‌های بیولوژیکی محیطی (باکتریهای تجزیه کننده) در جهت حذف هیدروکربنهای نفتی که در این تحقیق ترکیبات آروماتیک میباشد نسبت به روشهای فیزیکی (سوزاندن) که آلودگی زیست محیطی ایجاد میکند و روش شیمیایی (سورفکتانت‌ها) که روشی پر‌هزینه و دارای محدودیت میباشد مزیتی قابل توجه‌ای دارد (MacGillirray and Shiaris et al 1999, 90-101; Vinas and Grifoll et al 2002, 252-261; Moslemi and Vosoughi et al 2005, 15-23). میزان تجزیه و معدنی شدن ترکیبات آلی وابسته به غلظت ترکیبات است بطوریکه غلظت بالای هیدروکربن‌ها با محدود کردن مواد غذایی و اکسیژن یا از طریق اثرات سمی ایجاد شده بوسیله هیدروکربنهای فرار از تجزیه زیستی ممانعت میکند. رشد میکرواورگانیسم‌ها روی هیدروکربن‌ها اغلب همراه با امولسیونه کردن منابع کربن نامحلول در محیط کشت است. در اغلب موارد این همراه با تولید عوامل امولسیونه کننده خارج سلولی در طی شکست هیدروکربن‌ها میباشد این فرآیند رشد میکرواورگانیسم روی نفت خام و متابولیزه کردن آن را امکان‌پذیر می‌سازد (حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80). در این تحقیق هدف بر این است که با جداسازی باکتریهای تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک در اکوسیستم ایران و بکارگیری آنها به روش تجزیه زیستی موجبات کاهش این آلاینده‌ها فراهم گردد. 1-3- اهمیت و ضرورت انجام تحقیقرشد روز افزون فعالیت‌های صنعتی از یک سو و عدم رعایت الزامات زیست محیطی از سوی دیگر که باعث افزایش آلاینده‌ها زیست‌محیطی در چند دهه اخیر شده، ضرورت جلوگیری و ایجاد روشهای بهینه‌تر و اقتصادی‌تر برای از بین بردن این آلودگی‌های محیطی بیش از پیش قابل توجه است. هیدروکربنهای نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط زیست تجمع می‌یابند. هیدروکربنهای نفتی آلاینده‌های اصلی محیط‌های دریایی هستند. خلیج فارس از متنوع‌ترین اکوسیستم‌های جهان است. در آب‌های این منطقه 57.1% آلودگی نفتی مربوط به حمل و نقل کشتی‌ها و 22.4% مربوط به بهره‌برداری از دریا است. آلودگی مزمن محیط با نفت منجر به بهم ریختگی اکولوژِیکی و مانع از استفاده پایدار آن توسط بشر می‌شود (R and J 2003, 1234-1243). مهمترین روشهای حذف این آلودگی‌ها جداسازی فیزیکی، جذب، ژل‌سازی، امولسیون‌سازی و تصفیه‌زیستی میباشد اغلب این روش‌ها براساس جابجا کردن، پخش نمودن و انتقال آلودگی‌ها بوده و باعث حذف کامل آلاینده‌ها نمی‌شوند(حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80). تجزیه‌زیستی مشتقات نفتی در محیط‌های آلوده موثرتر, قوی‌تر و از نظر اقتصادی مقرون به‌صرفه‌تر از روشهای فیزیک و شیمیایی است (Fedorak and Westlake 1981, 367-375). هیدروکربنهای آروماتیک پلی‌سیکلیک (PAH) از دو یا چند حلقه شش عضوی تشکیل شده‌اند که این حلقه‌ها توسط اشتراک یک جفت اتم‌های کربن بین حلقه‌ها جوش‌خورده و بهم متصل شده‌اند و ساده‌ترین عضو این گروه نفتالین (C10H8) است (Zaidi and Imam 1999, 737-742) تا کنون 16 ترکیب PAH در فهرست سازمان حفاظت محیط زیست آمریکا, بعنوان آلاینده‌های مهم آمده است. از مهمترین آنها میتوان به نفتالین, آنتراسین, فنانترن, فلورن, کریزن, فلورانتن, پیرن, مشتقات آنها اشاره کرد (R and J 2003, 1234-1243) بازیافت، تصفیه و دفع این مواد شیمیایی سمی اهمیت زیادی دارد و در حال حاضر تصفیه زیستی، یکی از فناوری‌های اصلی برای رفع آلودگی زیست محیطی به شمار می‌رود. روشهای بیولوژیکی علاوه بر اینکه کم هزینه‌تر و موثرتر میباشد، سازگاری بیشتری نیز با محیط زیست دارند. تحقیقات بر روی تجزیه‌زیستی ترکیبات نفتی نشان داده است که این روش بهترین و موثرترین روشهای حذف ترکیبات نفتی از محیط زیست (خاکی و آبی) میباشد(حسن شاهیان و همکاران 1387، 8-1؛ طلایی و همکاران 1388، 68-57؛ طلایی و همکاران 1389، 68-80). 1-4- ادبیات تحقیقبرخی از تحقیقات انجام شده در زمینه جداسازی و شناسایی باکتریهای تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک عبارتند‌از: Sislerو همکاران در سال 1987 با استفاده از Pseudomonas fluorescensدر تحقیق خود در تجزیه بیولوژیکی خاک‌های آلوده نفتی دریافتند که این سوش قادر است n آلکان‌های زنجیره کوتاه و بلند و همچنین تعدادی از هیدروکربنهای آلیفاتیک و آروماتیک را تجزیه و تخریب کند (Sisler and Zobell 1987, 521-522), یکسال بعد یعنی 1988 Vales-Garciaو همکارانسویه‌ی جدیدی از Pseudomonasکه توانایی تجزیه نفتالین دارد را جداسازی کردند (García-González and Govantes et al 2003, 7). پس از آن در سال 1989, Cerniglia و همکاران متابولیسم ترکیبات آروماتیک چند حلقه‌ای را در محیط‌های آبی بررسی کردند (Heitkamp and Cerniglia 1989, 1989-1994), سپس Folsom و همکاران در سال 1990 تاثیر Pseudomonas cepacia را بر تجزیه فنل بررسی کرد (Folsom and Chapman et al 1990, 1279-1285). بررسی اثر سویه‌های Alcaligenesبرتجزیه‌زیستی ترکیبات آروماتیک همچون نفتالین, فنانترن یا پیرن توسطWeissenfels و همکاران در سال 1990انجام شد (Weissenfels and Beyer et al 1990, 6). پس‌از آن Grifoll و همکاران در سال 1992 باکتریهای تجزیه کننده فلورن را جداسازی و شناسایی کردند (Boldrin and Tiehm et al 1993, 1927-1930) و یکسال بعد Boldrinو همکاران در سال 1993 سویه‌هایی از باکتری Mycobacteriumبا توانایی تجزیه فنانترن را جداسازی کردند (Boldrin and Tiehm et al 1993, 1927-1930). جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Powlowski و همکاران در سال 1994 انجام شد (Powlowski and Shingler et al 1994, 219-236). MacGillivray and Shiaris در همان سال چند میکروارگانیسم تجزیه کننده نفتالین شاملAlcaligenes denitrificans, Mycobacterium sp., Rhodococcus sp., Corynebacterium venale, Bacillus cereus, Moraxella sp., Streptomyces sp. را جداسازی کردند (Macgilliray and Shiaris 1994, 1154-1159) پس از آن طی تحقیقی Ahmed در سال 1995 تاثیرPseudomonas aeruginosaرا برتجزیه فنل بررسی کرد (Ahmeda and Nakhlaa et al 1995, 99-107). Kirkو همکاران در سال 1997تاثیر Ochromonas danica رابر تجزیه فنل بررسی کردند (Kirk and Ronald 1997, 133-139). بررسی اثر Phanerochaet chrysosporium تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Perez و همکاران در سال 1997انجام شد (Perez and Benito et al 1997, 207-213), سپس اثر Rhodococcus spp بر تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Margesin و همکاران در سال 1997سنجیده شد (Margesin and Schinner 1997, 462-468) و پس‌از آن در همان سالAlcaligenes xylosoxidans Y234 بعنوان تجزیه کننده فنل توسطSung Ho وهمکاران معرفی شد (Sung Ho and Seung Ho et al 1997, 37-40) و نیز Arthobacter species بعنوان تجزیه کننده فنل توسط S.Kar و همکاران در سال مشابه معرفی گردید (Kar, Swaminathan et al. 1997). Bandhyopadhyay و همکاران در سال 1998 تاثیر Pseudomonas putida بر تجزیه فنل را بررسی کردند (Bandyopadhyay and Das et al 1998, 373-377). از طرفیAitken و همکاران نیز در سال 1998 مشاهده کردند که Bacillus cereus در حضور نفتالین رشد میکند (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752) در سال 2000 Kazunga و Aitken اعلام کردن که Sphingomonas yanoikayae R10 و Pseudomonas stutzeri P16و Pseudomonas stutzeri P15 و Bacillus cereus R1 توانایی تجزیه پیرن را دارا می‌باشند (Kazunga and Aitken 2000, 1917-1922.). Eduardo و همکاران در سال 2000 باکتری Alcaligenes faecaliو مخمر Candida tropicaرا که قادر به تجزیه فنل بودند را گزارش کردند (Eduardo and Bastos et al 2000, 346-352)اثرNeptunomonas وStenotrophomona بر تجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک در سال 2000 توسط Ho و همکاران بررسی گردید (Ho and Jackson et al 2000, 100-112) یکسال بعد جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Gonzales و همکاران در سال 2001 به انجام رسید (Gonzalez et al 2001, 137-142) از طرفی Santos و همکاران در سال 2001 تاثیر Trichosporon species LE3 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Santos and Heilbuth et al 2001, 171-178). Aleksieva و همکاران نیز در سال 2002 تاثیر TrichosporoncutaneumR57 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Aleksieva et al 2002, 1215-1219). در همان سال Begona و همکاران در سال 2002 تاثیر Rhodococcus erythropolis UPV-1 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Begoña Prieto et al 2002, 1-11). اثر Cycloclasticus بر تجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک در سال 2002 توسط Kasai و همکاران بررسی گردید (Kasai et al 2002, 5625-5633). بررسی اثر سویه‌هایRhodococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Micrococcus برتجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک همچون نفتالین, فنانترن یا پیرن توسطSamante و همکاران در سال 2002 انجام شد (Samanta et al 2002, 243-248). Wurster و همکاران در سال 2003 تاثیر Cyanobacterium synechococcus را بر تجزیه فنل بررسی کردند(Wurster et al 2003, 171-176). Filonov و همکاران نیز در سال 2003 به این نتیجه رسیدند که تجزیه نفتالین توسط سویه‌های باکتری Pseudomonas putidaبا گذشت زمان افزایش می‌یابد (Filonov et al 2003, 303-308)جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسطKumar و همکاران در سال 2005انجام شد (Kumar et al 2005, 151-159)Ahmad و همکاران در سال 2005 نیز تاثیر Phanerochaete chrysosporium را بر تجزیه فنل بررسی کردند و معرفی Arthobacter citreus بعنوان تجزیه کننده فنل که توسطChandrakant و همکاران در سال 2005 به انجام رسید (Chandrakant et al 2005, 47-55). از طرفی Bielefeldt و همکاران درسال 2005 تاثیر Sphingomonas chlorophenolica RA2 را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Bielefeldt and Cort 2005, 680-689)، سپس Irina و همکاران در سال 2006 تاثیر Rhodotorula creatinivora را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Irina et al 2006, 441-449). در همان سال نیز Arutchelvan و همکاران تاثیر Bacillus brevis را بر تجزیه فنل بررسی کردند (Arutchelvan et al 2006, 216-222). بررسی اثرCandida tropicalisبر تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Yan و همکاران در سال 2006انجام شد (Yan et al 2006, 226-231) اثر سویه‌های Candida نیز بر تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Hu و همکاران در سال 2006 مورد بررسی قرار گرفت (Hu et al 2006, 899-906), از طرفی اثر Bacillus brevis بر تجزیه این ترکیبات توسطArutchelvan و همکاران در سال 2006 بررسی شد (Arutchelvan et al 2006, 216-222). جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسطKulkarni و همکاران در سال 2006به انجام رسید (Kulkarni and et al 2006, 3361-3369) پس از آنVanessa Leonardi و همکاران در سال 2007 در تجزیه هیدروکربنهای آروماتیک پلی‌سیکلیک در خاک‌های صنعتی آلوده قدیمی نشان دادند که میکروارگانیسمها باعث تخریب 73-58 درصد از PAHهای 3و 4 حلقه‌ای می‌باشند (Leonardia and Sasek 2007, 165-170). جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Afzal و همکاران و نیز Yang و همکاران در سال 2007 انجام شد (Yang and Lee 2007, 206-210) در آن سالاثرPenicillium chrysogenum برتجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Leitao وهمکاران بررسیشد(Leitao et al 2007, 220-225). ازطرفیاثرسویههایAlcaligenes بر تجزیه این قبیل ترکیبات توسط Nair و همکاران در سال 2007 مورد بررسی قرار گرفت و نیز بررسی اثر سویه‌های Ochrobactrum بر تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Kilic و همکاران در سال 2007 به انجام رسید (Kilic et al 2007, 826-831) در همان سال اثر سویه‌هایMycobacteriumبرتجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک همچون نفتالین, فنانترن یا پیرن توسطPagnout و همکاران در سال 2007مورد بررسی قرار گرفت (Pagnout et al 2007, 175-186) سپس معرفی Alcaligenes faecalis بعنوان تجزیه کننده فنل توسط Yan Jiang و همکاران در سال 2007 انجام شد و پس از آن معرفی Arthrobacter chlrophenolicus A6 بعنوان تجزیه کننده فنل که توسط Maria Unell و همکاران درسال 2007 انجام شد از طرفی Annadurai و همکاران در سال 2007 تاثیر Pseudomonas pictorum را بر تجزیه فنل بررسی کرد و همچنینSunil و همکاران در سال 2007 تاثیر Candida tropicalis را بر تجزیه فنل بررسی کردند در همان سالYan Jiang و همکاران تاثیرCandida tropicalis NICM3556را بر تجزیه فنل بررسی کردند از طرفی Cai و همکاران در سال 2007 تاثیر Graphium sp FIB4 را بر تجزیه فنل بررسی کردند سپس Stoilova و همکاران در سال 2007 تاثیرAspergillus awamori NRR1 3112 را بر تجزیه فنل بررسی کردند پس از آن Kotresha و همکاران در سال 2008 تاثیر Pseudomoas aeruginosa MTCC4996 را بر تجزیه فنل بررسی کرد (Kotresha and Vidyasagar 2008, 541-547). همچنین Tallur و همکاران در سال 2008 تاثیر Bacillus species stam PHN1 را بر تجزیه فنل بررسی کردند از طرفی Annadurai و همکاران در سال2008 تاثیرPseudomonas putida بر تجزیه فنل را بررسی کردند و نیز جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسطKotresha و همکاران در همان سال انجام شد (Kotresha and Vidyasagar 2008, 541-547). پس از آن جداسازی سویه جدیدی از Pseudomonas با توانایی تجزیه فنل و ترکیبات فنلی توسط Saravanan و همکاران در سال 2008 انجام شد (Saravanan, K. et al. 2008) و اثرSphingomonas بر تجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک در سال 2008 توسط Desai و همکاران بررسی گردید از طرفی در همان سال L. Feijoo-Siota و همکاران در تحقیقات خود به مثبت بودن نتیجه تجزیه بیولوژیکی نفتالین با استفاده از باکتری Pseudomonas.stutzeriرسیدند (Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) و همچنینSong و همکاران در سال 2009 تاثیرPseudomonas aeruginosaرا بر تجزیه فنل بررسی کردند و نیز در همان سال Varma و همکاران تاثیر سویه‌های Fusarium را بر تجزیه این ترکیب بررسی کردند در سال بعد یعنی 2010 Bisht و همکاران طی تحقیقات خود بر روی تجزیه بنزن, تولوئن, زایلین و مخصوصا آنتراسین و نفتالین اعلام کردند که سویه‌های,Deinococcus radiodarans, Micrococcu varians, KurthiaBacilluscirculans توانایی تجزیه این ترکیبات حلقوی را دارند و همچنین Muangchinda و همکاران در سال 2013 اثر سویه‌های مختلفDyella, Luteibacter, Burkholderia, Alcaligenes Ochrobactrum را بر تجزیه ترکیبات آروماتیک بررسی کردند از طرفی Gulvik و همکاران درسال 2013 تاثیر Sagittula stellata E-37 را در تجزیه ترکیبات آروماتیک بررسی کرده و ژن مربوطه را استخراج و شناسایی کردند سپس در همان سال Egorova و همکاران اثرRhodococcus wratislaviensis KT112-7 را بر تجزیه ترکیبات آروماتیک بررسی کردند برطبق بررسی‌های Badejo و همکاران در سال 2013Mycobacterium gilvum PYR-GCK, در تجزیه ترکیبات آروماتیک نقش دارد و نیز Agarry و همکاران در سال 2013 تأثیر Pseudomonas aeruginosa را بر تجزیه هیدروکربنهای حلقوی بررسی کردند و بسیاری تحقیقات دیگر که بر روی تجزیه انواع ترکیبات آروماتیک انجام شده و نتایج حاصل از هرکدام به بیان انواع مختلفی از باکتریهای تجزیه کننده ختم شده است. 1-5- اهداف تحقیق1-5-1 اهدف کلیتعیین نوع باکتریهای تجزیه کننده‌ی ترکیبات آروماتیک درخلیج‌فارس منطقه ساحلی استان بوشهر 1-5-2 اهداف جزئی
1-5-3 اهداف کاربردیدسترسی به انواع باکتریهای تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک جهت استفاده در تحقیقات آینده وبرای پاکسازی محیط‌های آلوده درخلیج‌فارس منطقه ساحلی استان بوشهر وسایر آلودگی‌های مشابه در دیگر نقاط کشور وحتی جهان. 1-6- سؤالات تحقیق1. آیا باکتریهای تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک در آب‌هایی با آلودگی نفتی در خلیج‌فارس منطقه ساحلی استان بوشهر وجود دارند؟ 2. نحوه پراکندگی این باکتری در اکوسیستم‌های آبی ایران چگونه است؟ 3. این باکتری‌ها به چه جنس و گونه‌هایی تعلق دارند؟ 4. حداکثر میزان تجزیه بوسیله این باکتری‌ها چقدر است؟ [1] Polycyclic Aromatic Hydrocarbons |
جداسازی و شناسایی باکتری ترشح کننده لیپاز خارج سلولی و مقاوم به حلال آلی و کاربرد آن در تولید بیودیزل
 جداسازی و شناسایی باکتری ترشح کننده لیپاز خارج سلولی و مقاوم به حلال آلی و کاربرد آن در تولید بیودیزلچکیده در پژوهش حاضر، شناسایی و تولید یک لیپاز خارج سلولی و مقاوم به حلال آلی از باکتری مقاوم به حلال آلی مد نظر بود. جستجوی باکتری با نمونه گیری از نواحی آلوده به حلال آلی و روغن صورت گرفت. از میان تعداد زیادی باکتری سویه ی IE-93 به عنوان مقاوم ترین باکتری ترشح کننده لیپاز نسبت به حلال های آلی انتخاب شد و آنالیز 16S rRNA نشان داد که باکتری مورد نظر از جنسStenotrophomonas میباشد. Stenotrophpmonas sp. strain IE- 93 در محیطمناسب ، 2 درصد زیتون ، (0/8pH~ )، دمای °C26 و rpm 180 کشت داده شد و پس از 72 ساعت بالاترین میزان ترشح لیپاز را از خود نشان داد. آنزیم توسط ستونهای کروماتوگرافی تعویض یونی Q-Sepharose و ژل فیلتراسیون Sephacryl S-200 خالص سازی گردید. لیپاز مورد نظر به میزان 29/2 برابر محیط کشت اولیه با بازده 22% خالص و دارای فعالیت ویژه U/mg27/ 77.میباشد.pH و دمای بهینهی آنزیم به ترتیب0/ 8 و ˚C 55 میباشد و در دمای ˚C60 ، حدود 80% از فعالیت لیپازی خود را حفظ می کند . فعالیتلیپاز IE-93 در حضور یون های فلزی تغییر محسوسی نکرد که این موضوع نشان می دهد که این آنزیم جز متالو آنزیم ها نمی باشد. با بررسی اثر حلال های آلی بر فعالیت آنزیمی مشخص شد آنزیم نسبت به حلال های آلی مختلف با دامنه ی وسیع میزان آب گریزی (log P) مقاومت مطلوبی نشان می دهد. فعالیت ترانس استریفیکاسیونی لیپاز استخراج شده از باکتری Stenotrophpmonas sp. strain IE-93 در دمای 40 درجه سانتی گراد و نسبت الکل به سو بسترا 3:1 و شرایط متفاوت حضور یا عدم حضور حلال آلی و نوع گیرنده اسیل (اتانول و متانول ) بررسی شد . واژگان کلیدی: لیپاز حلال آلی Stenotrophomonas ترانس استریفیکاسیون بیودیزل فهرست مطالب عنوان صفحه فصل اول مقدمه2 1-1- آنزیم های مقاوم به حلال های آلی2 1-2- لیپازها4 1-3-منابع آنزیم لیپاز5 1-3-1- لیپازهای گیاهی5 1-3-2-لیپازهای جانوری5 1-3-3- لیپازهای میکروبی5 1-4- طبقه بندی لیپازها7 1-5- ساختار لیپازها8 1-5-1- ساختار لیپازها و مقاومت آن ها به حلال های آلی8 1-6- مکانیسم عمل لیپازها8 1-7- انواع واکنش های لیپازی9 1-8- واکنش در حلال های آلی11 1-9- باکتری های مقاوم به حلال های آلی11 1-10- کاربردهای صنعتی لیپازها و لیپازهای مقاوم به حلال آلی 12 1-11- سوخت های زیستی 12 عنوان صفحه 1-10-1-اتانول زیستی13 1-10-2- گاز زیستی14 1-10-3- سوخت سبز14 1-10-4- زیست دیزل یا بیودیزل14 1-10-4-1- روش های تولید بیودیزل15 1-10-4-2- کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون... 18 1-10-4-2-1- کاتالیزورهای قلیایی18 1-10-4-2-2- کاتالیزورهای اسیدی18 1-10-4-2-3- آنزیم ها (لیپازها) به عنوان کاتالیزورهای واکنش ترانس استریفیکاسیون................................ 19 1-10-4-2-4 – مزایا و محدودیت های استفاده از آنزیم ها (لیپازها) به عنوان کاتالیزور به جای اسید و قلیا 20 فصل دوم مروری بر پژوهش های پیشین..................... 22 اهداف پژوهش.................................. 25 فرضیه........................................ 25 فصل سوم ابزار ، مواد و روش ها........................ 27 عنوان صفحه 3-1- ابزار و دستگاه ها....................... 27 3-2- مواد شیمیایی و آزمایشگاهی............... 28 3-3- نرم افزارها............................. 28 3-4- روش ها.................................. 29 3-4-1- نمونه برداری.......................... 29 3-4-1-1- تهیه ی نمونه ها..................... 29 3-4-1-2- آماده سازی نمونه ها................. 29 3-4-2- محیط های کشت باکتری................... 30 3-4-2-1- محیط کشت جامد جهت جداسازی تک کلونی ها30 3-4-2-2- شناسایی و جداسازی کلونی های باکتریایی30 3-4-3- محیط کشت افتراقی جهت جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی............................................. 30 3-4-4- جداسازی باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی 31 3-4-4-1-محیط جامد تریبوتیرین آگار............ 31 3-4-4-2- محیط جامد Tween..................... 32 3-4-4-3- محیط جامد ردامین B- آگار............ 32 3-4-5- محیط ترشح آنزیم لیپاز خارج سلولی...... 33 3-4-6- تعیین خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93... 35 3-4-6-1- رنگ آمیزی گرم....................... 35 3-4-7-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)....... 36 عنوان صفحه 3-4-7-3- الکتروفورز محصول حاصل از PCR........ 36 3-4-7-4- خالص سازی محصول PCR از ژل آگارز..... 37 3-4-7-5 – استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک برای تجزیه و تحلیل توالی به دست آمده...................... 38 3-4-8- سنجش فعالیت آنزیم لیپاز............... 39 3-4-8-1- سنجش فعالیت آنزیمی به روش رنگ سنجی.. 39 3-4-8-1-1- استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (PNPP) 39 3-4-8-1-2- استفاده ازسوبسترای پارانیتروفنیل بوتیرات (PNPB) 39 3-4-8-2- سنجش فعالیت آنزیمی به روش Cuppric reagent40 3-4-10- تخلیص آنزیم لیپاز.................... 41 3-4-10-1- جمع آوری آنزیم خام................. 41 3-4-10-2- آماده سازی فرایند دیالیز........... 42 3-4-10-3- ستون Q-Sepharose..................... 42 3-4-10-3-1- بازیافت و بهبود رزین............. 42 3-4-10-3-2- روش استفاده از ستون Q-Sepharose برای تخلیص43 3-4-10-4-ستون Sephacryl S-200................... 43 3-4-10-4-1-بازیافت و بهبود رزین.............. 43 3-4-10-4-2- روش استفاده از ستون Sephacryl S-200. 44 3-4-11- سنجش کمی پروتئین به روش برادفورد..... 44 عنوان صفحه 3-4-11- بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم لیپاز سویه IE-93 45 3-4-11-1- بررسی نیمرخ دمایی.................. 45 3-4-11-2- بررسی نیمرخ pH..................... 45 3-4-11-3- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف46 3-4-11-4- بررسی پایداری آنزیم در pH های مختلف46 3-4-11-5- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی 47 3-4-11-6- بررسی اثر حلال های آلی:............. 47 فصل چهارم نتایج........................................ 50 4-1- نمونه برداری............................ 50 4-2- جداسازی باکتری ها بر اساس مشخصات کلونی ها برروی محیط جامد............................................. 51 4-3- جداسازی باکتری های مقاوم به حلال آلی..... 52 4-4- غربال گری باکتری های ترشح کننده لیپاز خارج سلولی 53 4-5-شناسایی باکتری........................... 56 4-5-1- خصوصیات مورفولوژیکی سویه IE-93......... 56 4-5-2- خصوصیات فیلوژنتیکی سویه IE-93.......... 57 4-5-2-1- استخراج DNA........................ 57 4-5-2-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) ، تکثیر 16S rRNA و تعیین توالی........................................ 5 عنوان صفحه 4-5-2-3- تجزیه و تحلیل توالی به دست آمده وموقعیت فیلوژنی باکتری stenotrophomonas sp.strainIE93در بین سایر باکتری ها.58 4-6- محیط ترشح آنزیم لیپاز................... 59 4-7- تخلیص آنزیم لیپاز....................... 60 4-8- تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم.......... 62 4-8-1- بررسی پارامترهای سنتیکی آنزیم......... 62 4-8-2- بررسی نیم رخ دمای آنزیم............... 63 4-8-3- بررسی نیم رخ pH آنزیم................. 63 4-8-4- بررسی پایداری آنزیم در دماهای مختلف... 64 4-8-5- بررسی پایدای آنزیم در pH های مختلف.... 65 4-8-6- بررسی اثر یون های فلزی بر فعالیت آنزیمی66 4-8-7- بررسی اثر حلال آلی..................... 67 فصل پنجم بحث ونتیجه گیری.............................. 72 منابع........................................ 76 چکیده به انگلیسی صفحه عنوان به انگلیسی فهرست جدول‌ها عنوان صفحه جدول 2-1-پژوهش های مختلف در زمینه تولید بیودیزل24 جدول 3-1- اجزا محیط جامد تریبوتیرین.......... 31 جدول 3-2 – اجزا محیط جامد Tween.............. 32 جدول 3-3- اجزا محیط جامد B- ردامین........... 33 جدول 3-4- اجزا محیط اولیه تولید لیپاز........ 34 جدول 3-5- اجزا محیط های طراحی شده توسط نرم افزار Expert 8.0.7.1Design- ................................ 34 جدول 3-6– نحوه تهیه مخلوط PCR............... 36 جدول 3-7- شرایط بهینه سنجش فعالیت آنزیم طراحی شده توسط نرم افزار Design- Experte8.0.7.1.......... 41 جدول 3-8 – اجزا مخلوط بافری.................. 46 جدول 4-1 – مشخصات نمونه ها................... 50 جدول 4-2- باکتری های شناسایی شده............. 52 جدول 4-3 – باکتریهای ترشح کننده لیپاز و مقاوم به حلال آلی55 جدول 4-4 –اجزا محیط کشت اولیه................ 59 جدول 4-5- ترشح آنزیم لیپاز در محیط های مختلف طراحی شده توسط برنامه Design Expert.................. 59 عنوان صفحه جدول 4-6- اجزا محیط کشت بهینه................ 60 جدول-4-7- مراحل خالصسازی آنزیم............... 62 جدول-4-8- مراحل تثبیت آنزیم.................. 69 جدول 5-1- شرایط تولید بیودیزل................ 75 فهرست شکل ها عنوان صفحه شکل 1-1- انواع واکنش های لیپازی.............. 10 شکل 1-2- واکنش ترانس استریفیکاسیون.......... 16 شکل 1-3- تبدیل تری گلیسرید به دی گلیسرید..... 16 شکل 1-4-تبدیل دی گلیسرید به مونوگلیسرید...... 17 شکل 1-5-تبدیل مونوگلیسرید به گلیسرول و اسید چرب17 شکل 1-6- واکنش متانولایزیس.................... 18 شکل 4-1-تک کلونی............................. 52 شکل 4-2- پلیت Tween.......................... 54 شکل 4-3- پلیت ردامین B- آگار................. 54 شکل 4-4 – رنگ آمیزی گرم...................... 56 شکل 4-5- رشد باکتری بر روی پلیت EMB......... 56 شکل 4-6– ژل الکتروفورز محصول PCR............ 57 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار 4-1 -کروماتوگرام مراحل خالص سازی لیپاز مربوط به سویه IE-93 از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی 61 نمودار 4-2 -کروماتوگرام ستون ژل فیلتراسیون S-200Sephacryl61 نمودار 4-3 - منحنی میکائلیس – منتن و منحنی لینوور- برک 62 نمودار 4-4 -نیم رخ دمایی آنزیم............... 63 نمودار 4-5 - نیمرخ pH آنزیم.................. 64 نمودار 4-6-پایداری آنزیم در دماهای مختلف در زمان 1 ساعت 65 نمودار 4-8 - اثر یون های مختلف بر فعالیت آنزیم67 نمودار 4-9- اثر حلال های آلی بر فعالیت نسبی آنزیم68 نمودار 4-10 - اثر غلظت های مختلف حلال آلی اتانول68 نمودار 4-11 - اثر غلظت های مختلف حلال آلی متانول69 فصل اولمقدمه1-1- آنزیم های مقاوم به حلال های آلیآنزیم ها کاتالیزگرهای فرایندهای زیستی هستند. ساخت مولکول های زیستی به واسطه فعالیت آنزیم ها صورت می گیرد. اغلب آنزیم ها ساختار پروتئینی دارند. به غیر از انواع محدودی از آنها که از جنس ریبو نوکلئیک اسید هستند. آنزیم ها به شدت اختصاصی عمل می کنند و نسبت به کاتالیزگرهای غیرزیستی کارایی بسیار بالایی دارند (ogina and Ishikawa., 2001 ).استفاده از آنزیم ها در واکنش ها در مقایسه با فرایندها شیمیایی به دلایل گوناگونی از جمله مصرف کمتر انرژی و بازده بالاتر برتری دارد. آنزیم ها انواع گوناگونی دارند. که شامل درون سلولی، متصل به غشاء و خارج سلولی یا ترشحی می گردد. آنزیم های ترشحی یا خارج سلولی به علت پایداری در دامنه ی وسیعی از دما و pH بیشتر مورد توجه هستند. این دسته از آنزیم ها که به طور کامل از سلول جدا شده و به صورت آزاد در محیط اطراف سلول، رها می شوند .(Faith Nevbeck et al., 1971) یکی از انواع پرکاربرد آنزیم های خارجی سلولی، آنزیم های مقاوم به حلال های آلی هستند . اکثر آنزیم ها در محیط آبی فعالیت دارند که این ویژگی برای بعضی از واکنش ها مناسب نمی باشد. ترکیب های آلی تجاری گاهی در آب ناپایدار و یا نامحلول می باشند و به بیانی آب حلال مناسبی برای این ترکیبات نمی باشد. بنابراین بهتر است که این دسته از واکنش ها در حضور مقادیری از حلال های آلی یا درآنها صورت گیرد. علاوه براین واکنش های سنتزی و ترانس استریفیکاسیون ها که در خلاف جهت واکنش های آبکافتی است در حضور حلال های آلی صورت می گیرد .(Ogino and Ishikawa., 2001, Hasan shah et al., 2006) از مزایای استفاده از آنزیم ها در حضور حلال های آلی می توان به موارد زیر اشاره کرد: - افزایش حلالیت سوبستراهای غیرقطبی - تغییرجهت تعادل ترمودینامیکی به سمت سنتز به جای هیدرولیز، محدود شدن واکنش های جابجایی وابسته به آب - تغییر در سوبسترا و انتخاب گری کایرالیته موردنیاز در صنایع شیمیایی و دارویی و افزایش پایداری دمایی و حذف آلودگی میکروبی با وجود این مزیت ها بیشتر آنزیم ها در حضور حلال های آلی، به ویژه حلال های آلی قابل امتزاج با آب پایدار نیستند. حلال های آلی معمولا مولکلول های آب را از سطح آنزیم و جایگاه فعال دور می کنند. بنابراین سبب غیرفعال شدن آنزیم ها می شوند(young et al., 2004 ). برای حل این محدودیت، راه کارهای متعددی به منظور افزایش پایداری یا فعالت آنزیم ها در حضور حلال های آلی پیشنهاد شده است .(Khmelnitsk et al., 1988) - تغییرات شیمیایی آنزیم ها با استفاده از لیپیدها یا سورفاکتانتها، تثبیت آنزیم بر روی بسترهای نامحلول، قرار دادن آنزیم ها در درون میسل ها، مهندسی پروتئین و مهندسی مولکولی از جمله ی این راه کارها می باشند. در سال ها اخیر پیشنهاد شده است که برای افزایش پایداری آنزیم ها درحضور حلال های آلی، از آنزیم هایی استفاده کرد که به صورت طبیعی نسبت به حلال های آلی مقاوم هستند به عبارت دیگر از آنزیم هایی می توان استفاده کرد که در طی فرایند انتخاب طبیعی در محیط مقاومت به حلال های آلی را کسب کرده اند. آنزیم هایی که به حلال های آلی مقاوم هستند به کو فاکتور نیاز ندارند و دارای کاربردهای تجاری و صنعتی حائز اهمیتی هستند. (yan et al., 2007) . 1-2- لیپازهالیپازها (EC3.1.1.3) یکی از مهمترین خانواده های بیوکاتالیست ها با کاربردهای متنوع می باشند. آنزیم لیپاز یکی از انواع آنزیم های محلول در آب است که هیدرولیز پیوندهای استری را در سوبستراهای لیپیدی انجام می دهد .(Jaeger et al., 1994)این آنزیم ها قادرند پیوندهای استری موجود در تری اسیل گلیسرول ها را شکسته و آنها را به اسیدهای چرب و گلیسرول مونوگلیسریدها و دی گلیسریدها تبدیل کنند و در شرایط حضور اندک آب نیز واکنشهای برگشتی را سبب می شوند) .(Jaeger and eggert., 2002 لیپازهای مقاوم به حلال های آلی برای چنین واکنش های بیشتر مورد توجه می باشند سوبسترای این آنزیم ها آب گریز است و محصولی را که تولید می کنند آب دوست می باشد. بنابراین تفکیک سوبسترا از محصول در فرآیندهای پایین دست مشکل ساز نخواهد بود .(Houde et al., 2004) از لحاظ عملکردی آنزیم های لیپاز سوبستراهای متنوعی داشته که شامل سوبستراهای طبیعی و سنتزی می شوند و به علاوه انتخابگری فضایی خوبی را از خود نشان می دهند Beisson et al., 2000)) 1-3-منابع آنزیم لیپاز1-3-1- لیپازهای گیاهیبیشتر لیپازهای گیاهی از دانه های روغنی مانند سویا، پنبه دانه، نارگیل، کنجد و بادام زمینی استخراج می شوند که غنی از گلیسرول (منبع انرژی برای رشد) هستند. غلات دارای تری گلیسریدهای کمتری می باشند .(Woolley and Petersen., 1999) استفاده از آنزیم های گیاهی از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیست، زیرا برای بدست آوردن مقدار کمی از این آنزیم ها به مقادیر بسیار بیشتری از گیاه مربوطه نیاز است. 1-3-2-لیپازهای جانوریلیپازهای شناخته شده ای که منشاء جانوری دارند شامل لیپازهای پانکراسی و معده ای پستانداران و لیپازهای مربوط به پوشش های معدی نشخوارکنندگان، لیپازهای گوارشی ماهی ها و بی مهرگان، لیپوپروتئین لیپازها، لیپازهای بافتی و لیپازهای موجود در شیر می باشند. این آنزیم ها به طور معمول از محصولات جانبی صنایع گوشت تهیه می شوند که به اندازه کافی در دسترس نیستند .(Shahani et al., 1976)
|
فضای مجازی
|
|
