دانلود فایل

تصویر 4-1 گرادیانت دمایی به منظور انتخاب دمای بهینه جهت انجام یک واکنش PCR برای ژن gyrA ، سمت چپ مارکر Primer D و سمت چپ مارکر Primer L می باشد، مارکر مولکولی bp100....................................... 47

تصویر 4-2نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر L ،مارکر مولکولی bp100........ 48

تصویر 4-3 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر L ،مارکر مولکولی bp100........ 49

تصویر 4-4 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر L ،مارکر مولکولی bp100........ 50

تصویر 4-5 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر L ،مارکر مولکولی bp100........ 51

تصویر 4-6 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر L ..... 53

تصویر 4-7 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر L...... 54

تصویر 4-8 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر L...... 55

تصویر 4-9 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر L...... 56

تصویر شماره 4-10 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر D ،مارکر مولکولی bp100 57

تصویر شماره 4-11 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر D ،مارکر مولکولی bp100 58

تصویر شماره 4-12 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر D ،مارکر مولکولی bp100 59

تصویر شماره 4-13 نتایج PCR به منظور تکثیر ژن gyrA در برخی ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط پرایمر D ،مارکر مولکولی bp100 60

تصویر 4-14 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر D...... 61

تصویر 4-15 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر D...... 62

تصویر 4-16 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر D...... 63

تصویر 4-17 نتایج مربوط به برش آنزیمی (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسیون در ژن gyrA، در برخی از ایزوله های مقاوم به نالیدیکسیک اسید توسط آنزیم Hinf1 مارکر مولکولی bp10 پرایمر مورد استفاده پرایمر D...... 64

تصویر 4-18 بررسی وجود ژن qnrS در سویه های جدا شده از نمونه های بالینی.......................................................... 65

تصویر 4-19 بررسی وجود ژن qnrA در سویه های جدا شده از نمونه های بالینی، مارکر مولکولی bp100....................................... 66

تصویر 4-20 بررسی وجود ژن qnrB در سویه های جدا شده از نمونه های بالینی، مارکر مولکولی bp100....................................... 67

تصویر3-21 نتایج گراف نمونه شماره 19....................... 69

تصویر3- 22 نتایج گراف نمونه شماره 24...................... 70

چکیده

شیگلوزیس بطور شایعی مربوط به کودکان بوده به طوری که در اغلب موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. فلوروکینولونها بطور موفقیّت آمیزی برای درمان شیگلوزیس، از جمله عفونتهای ناشی از سویههای با مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی استفاده میگردند. اما به مرور زمان سویه های مقاوم آنتی بیوتیکی به وجود آمده است، اهمیّت این موضوع به این دلیل است که مصرف بی رویه و غیر منطقی آنتی بیوتیک بدون توجه به الگو های مقاومتی می تواند باعث ظهور سویه هایی شود که حتی به درمان های جدید نیز مقاومت داشته باشند و ظهور سویه های جدید مقاوم به نالیدیکسیک اسید روشن کننده این واقعیّت می باشد. بنابراین بررسی مولکولی این نوع مقاومت ها بسیار حائز اهمیّت خواهد بود. گزارشات در خصوص بروز سویههای شیگلا مقاوم به فلوروکینولون ها محدود است. لذا مطالعه حاضر با هدف بررسی فراوانی موتاسیونهای ژن gyrA ژنهای و وجود qnr در سویههای شیگلا های جدا شده از بیماران مبتلا به شیگلوز در تهران انجام گردید. در مجموع 73 سویه شیگلا جدا شده از موارد بالینی در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت. سویههای شیگلا با استفاده از روشهای استاندارد میکروبیولوژیک جداسازی و تعیین هویت گردیدند. تست حساسیت آنتی بیوتیکی و غربالگری سویههای شیگلا مقاوم به فلوروکینولونها مطابق با دستورالعملهای استاندارد CLSI انجام پذیرفت. حضور ژنهای qnr از جمله qnrA، qnrB و qnrS توسط تکنیک PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکثیر از لوکوس ژنتیکی ناحیه مقاومت کینولونی ژن gyrA با استفاده از PCR انجام پذیرفت. سپس موتاسیونهای ژن gyrA توسط تکنیکRFLP و با استفاده از آنزیم محدود الاثر HinfI تعیین گردید. تمام آمپلیکونهای مربوط به نمونههای موتانت مشخص شده توسط هضم آنزیمی با ترادف یابی مورد تایید قرار گرفت. نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی 73 نمونه بالینی شیگلا نشان داد که 2/97 درصد از ایزوله ها حداقل به یکی از 18 آنتی بیوتیک مقاومت نشان می دهند و بیشترین میزان مقاومت به آنتی بیوتیک ها به ترتیب تری متوپریم+سولفامتوکسازول (5/ 94 درصد) و بعد از آن استرپتومایسین (2/93 درصد) و تتراسایکلین (2/93 درصد) بود. همچنین هیچ ایزوله ای به آنتی بیوتیک سیپروفلوکسازین و سفتی زوکسیم مقاومت نشان نداد. 23 (6/31 درصد) ایزوله مقاومت به نالیدیکسیک اسید را نشان دادند. همچنین تمامی نمونه های موتانت پس از PCR با استفادهاز پرایمر DgyrA و سپس بدنبال انجام هضم آنزیمی الگوی باندی 234و277 جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمر LgyrA الگوی باندی315 و333 را به نمایش گذاشتند. نمونه های نرمال حاصل از تکثیر پرایمر DgyrA نیز پس از انجام RFLP قطعات99و178و234جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمر LgyrA قطعات99و234و315 جفت باز را نمایش دادند. تمامی نتایج با Sequencing تایید گردید. در خوانش کامل اولیه از موتانت های واجد موتاسیون در ژن gyrA، تغیر نقطه ای در کدون83 نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. نتیجه این تغیر، جایگزینی اسید آمینه سرین به لوسین بود. در خوانش کامل دومین موتانت های واجد موتاسیون در ژن gyrA، تغیر نقطه ای در کدون83 نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. از میان دو نمونه موتانت شیگلا 1 نمونه (50درصد) به سروتایپ شیگلا فلکسنری و 1 نمونه (50درصد) به سروتایپ شیگلا سونئی تعلق داشت. از میان 23 سویه مقاوم شیگلا مقاوم به نالیدیکسیک اسید، 4 نمونه واجد ژن qnrS بودند.مطالعه حاضر، برای اولین بار به صورت جامع، مکانیسم مولکولی مقاومت به نالیدیکسیک اسید در سویههای شیگلا در تهران را مشخص نمود.

واژههای کلیدی: موتاسیونهای gyrA، نالیدیکسیک اسید، ژن qnr، شیگلا

فصل اول

کلـیات تحقیق

1- مقدمه

1-1 بیان مسئله

شیگلا یکی از اعضای خانواده بزرگ باکتریهای روده ای یعنی انتروباکتریاسه می باشد. بیش از چهل سروتایپ مختلف از این باکتری در چهار گونه یا سروگروه اصلی شامل: سروگروهA ( شیگلا دیسانتریه)، سروگروه B (شیگلا فلکسنری)، سروگروه C (شیگلا بوئیدی) و سروگروه D (شیگلا سونئی) شناسایی شده اند. بیماری شیگلوز (دیسانتری یا اسهال خونی باسیلی) یک گاستروانتریت ناشی از آلودگی با گونه های باکتریایی جنس شیگلا می باشد ; 2003)Ranjbar et al). شیگلوز همراه با درد های شدید شکمی، درد، تب، مدفوع خونی و موکوسی شناخته می شود. در میان 50 سروتایپ شیگلا دیسانتری تیپ 1 به شدت بیماری زا می باشد(et al; 2005Niyogi).

دیسانتری باسیلی بطور شایعی مربوط به کودکان بوده به طوری که هفتاد درصد از موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. شیگلوز از طریق دهانی - مدفوعی انتقال می یابد. این بیماری در ابتدا از طریق دستان آلوده افراد و به میزان کمتر از طریق آب یا غذای آلوده منتقل می شودRanjbar et al; 2008)).

سالانه 5 میلیون مورد مرگ و میر ناشی از گاستروانتریت در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد که دست کم ده درصد این موارد به دلیل دیسانتری ناشی از شیگلا است (Koorosh et al; 2003). اغلب موارد شیگلوز در سنین پس از شیر خوارگی به خصوص در سن نوپایی دیده می شودMache et al; 1997)). اثر منفی عفونت شیگلایی بر رشد و نمو و سوء تغذیه کودکان در مطالعات مختلف نشان داده شده است. شیوع عفونت شیگلایی در میان عوامل ایجادکننده گاستروانتریت های حاد بر اساس مطالعات انجام شده در تهران 1 تا 2 در صد می باشد. به نظر می رسد، تنوع فراوانی الگو های ژنتیکی موجود در یک گونه شیگلا مانند: شیگلا سونئی در یک کشور باعث بروز الگوها ی متنوع مقاومت به آنتی بیوتیک شده است. الگوی متنوع مقاومت به آنتی بیوتیک در نقاط مختلف جغرافیایی همواره انتخاب یک داروی مناسب برای شیگلا را مشکل کرده است و به همین علّت، انجام مطالعات مقاومت دارویی ضروری است. با توجه به افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف در سال های اخیر در نقاط مختلف دنیا، انتخاب بیماران که کاندیدهای درمان آنتی بیوتیکی هستند از اهمیّت بالایی برخورداراست (Peirano et al; 2006).

پاتولوژیپیچیدهسندرماسهالخونیبازتابیازوجود ترکیباتمتنوعژنتیکی کنترل کنندهبیماریزاییاینارگانیسماست.مهمترین عامل بیماری زا در این باکتری اگزو توکسین آن می باشد، که به دو زیر واحد A وB با سمیّت بسیار بالا تقسیم می شود که یک مولکول هگزامری با وزن مولکولی حدود 70 کیلو دالتون است که با اتصال به رسپتور های سطحی سلول هدف باعث اپوپتوزیس و مرگ سلول خواهد شد. این توکسین را شیگلا دیسانتری نوع 1 تولید می کند و توکسینی مشابه آن را اشرشیا کولی تولید می کند به نام های 1stx و2stx که تا 98 درصد تشابه دارند. حساسیت سلول های اندوتلیال کلیه انسان به stx در مقایسه با 1stx تا 1000 برابر بیشتر است به همین دلیل عامل اصلی بیماری خون ادراری HUS معرفی گردیده است. سمیّت و قدرت ایمنی زایی شیگا توکسین stx بسیار بالا می باشد به شکلی که حدود 28 نانو گرم از آن باعث مرگ یک موش می شود و همچنین به دلیل داشتن قدرت آنتی ژنی بالا دارای پتانسیل ایجاد پاسخ ایمنی و تولید آنتی بادی علیه توکسین در بدن بیمار می شود. زیر واحد stxBبا 69 اسید آمینه و زیر واحد stxAبا حدود 294 اسید آمینه با وزن مولکولی در حدود 32 کیلو دالتون متصل است. رسپتور زیر واحد B به رسپتور سطحیGb3 متصل شده و تشکیل یک کمپلکس را می دهد (Goguen et al; 2003).

افزایش مقاومت نسبت به اکثر آنتی بیوتیک های رایج به یک نگرانی بزرگ در کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه تبدیل شده است. کینولونها ازجمله نالیدیکسیک اسید به عنوان داروی خط اول در درمان عفونت های ناشی از شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد، اما متأسفانه در برخی از مطالعات مقاومت به این آنتی بیوتیک گزارش شده است.برای مثال در ایران نتایج مطالعات نشان داده است در سال های 2001 تا 2003 ، میزان مقاومت به این آنتی بیوتیک 13 درصد بوده و این میزان در سال های 2004 تا 2006 به 25 درصد افزایش یافته است. نالیدیکسیک اسید به دلیل مقرون به صرفه بودن از مناسب ترین آنتی بیوتیک ها به شمار می آید. کینولون ها و فلوروکینولون ها ترکیباتی هستند که هدف آنها DNA جیراز و توپوایزومراز IV می باشد و با ایجاد کمپلکس دارو سبب جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک می شوند. با توجه به افزایش مقاومت و انجام نگرفتن مطالعات جامع مولکولی بر روی سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید، بر آن شدیم به مطالعه شیوع موتاسیون ها بر روی ژنgyrA و بررسی وجود ژنهای qnr در سویه های سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید شیگلا جدا شده در تهران بپردازیم.

1-2 کلیات

1-2-1 باکتریولوژی شیگلا

شیگلا متعلق به خانواده انتروباکتریاسه می باشد. این باکتری غیر متحرک و بدون کپسول می باشد. 4 گونه شیگلا وجود دارد که بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی مختلف طبقه بندی می شوند. زیر گروه A (شیگلا دیسانتریه)، زیر گروه B (شیگلا فلکسنری)، زیر گروه C (شیگلا بوئیدی) و زیر گرو ه D)شیگلا سونئی) می باشند. شیگلا دیسانتریه بیشتر مورد توجه می باشد چون بیماری حاد تری را ایجاد می کند و عامل ایجاد اپیدمی های مختلف با ارگانیسم های مقاوم به آنتی بیوتیکی و تولید کننده شیگا توکسین می باشد. این دسته از باکتریهایرودهایبیهوازیاختیاری،اکسیدازمنفی،لاکتوزمنفیوغیرمتحرکاند،قادربهتخمیرگلوکزبودهوازتخمیر گلوکزگازتولیدنمیکنند،اوره منفیو همچنینسیتراتمنفیهستند.

درمحیطTSI، هیدروژنسولفوره (H2S)تولیدنکردهو لیزینمنفیمیباشند. هوازیوبیهوازیاختیاریوحرارتمناسببرایرشدآنها 37 درجه می باشد. این باکتریها یکی از مهمترین عوامل بیماریزای قابل انتقال از طریق غذا و آب آلوده بوده و به عنوان یکی از مشکلات بهداشتی در سراسر جهان محسوب می گردند (Brooks et al; 2007).

1-2-2 طبقه بندی شیگلا

نامشیگلابرگرفتهازناممیکروبشناسژاپنی Kiyoshi Shiga میباشدکهاولینباراینارگانیسمرادرسال1896 کشف نمود. جنسشیگلاشامل4گونهمیباشد:شیگلادیسانتریه،شیگلافلکسنری،شیگلابوئیدی،وشیگلاسونئی. شیگلا دیسانتریه یا زیر گروه A شامل 10 سروواراست،هرسروواریکآنتیژناختصاص به خود داردکهبوسیلهآنمتمایزمی شود. شیگلا فلکسنرییازیرگروه B شامل 8 سروار و 9 ساب سروار می باشد. سروار ها از نظر آنتی ژنی به هم وابسته هستند اما هرکدامیکآنتیژنبزرگمتمایزدارند. شیگلابوئیدییازیرگروه C شامل15سروواراستوهرسروار یکآنتیژناختصاصیدارد. آنهاممکناستباآنتیسرم های سایرگونههایشیگلاواکنشمتقاطعایجادکنند،امادرتشخیصآنهاتداخلیپیشنمیآید . شیگلاسونئییازیرگروه D تنهاداراییکسرووارمیباشدکهدردوفاز II و I وجوددارد،وهرفازیکآنتیژناختصاصیدارد. باکتری ممکناستدرطیدوره بهبودییادراواخردورهبیماریازبیمارانمبتلاجداشود .آنتیسرم هایاختصاصی IIفاز برایتشخیصهردوفازموردنیازاست Ranjbar et al; 2003)).

بیماری شیگلوز عمدتاً توسط شیگلا سونئی، شیگلا فلکسنری A و شیگلا دیسانتری تیپ 1 ایجاد می شود که در کشور های در حال توسعه شیوع بیشتری دارند. شیگلا دیسانتریه تیپ 1 بیماری حاد ایجاد می کند و می تواند عوارض مرگ باری به وجود آورد. این تیپ معمولا مقاوم به چند دارو بوده و باعث مرگ ومیر بالا می شود.

1-2-3 فاکتورهای ویرولانس شیگلا

آنها در ابتدای ورود به روده می توانند ایجاد بیماری کنند زیرا قابلیت حمله به سلول های روده کوچک را دارند. ژنومکروموزومیوخارجکروموزومی برایبهوجودآمدناینفنوتیپبیماریزاضروریاست.یکیازجنبههای اینفنوتیپ،تهاجمبهسلولهایاپتلیالیکولوناستکهترکیبژنتیکیآنبر روییکپلاسمیدبزرگ می باشد(1987Bysse et al;).یکی از فاکتور های ویرولانس آنها لیپوپلی ساکارید صاف می باشد که در دیواره سلول قرار می گیرد. شیگا توکسین دارای دوزیر واحد A و B است. زیر واحد A زیر واحد ساختاری این توکسین می باشد، زیر واحد Aقسمت S 28 از RNA ریبوزومی مربوط به زیر واحد S 60 را می شکند بنا براین مانع از اتصال آمینو اسیل ترانسفراز به RNA شده و در نتیجه با مهار سنتز پروتئین، اثرات مخرب خود را بر روی اپیتلیوم روده بر جای می گذارد. زیر واحدB اتصالی است. زیر واحد B اتصال به رسپتور های اختصاصی سلول را به نام گلیکولیپید Gb3واسطه گری می کند و سبب تسهیل ورود زیر واحد A به داخل سلول می شود. شیگا توکسین باعث ایجاد سندروم همولیتیک اورمیک می شود و مکانیسم این علائم پاتوژنیک، ممکن است در اتصال توکسین به اپیتلیال باشد که نتیجه آن همولیز و پارگی مویرگ ها و ضایعات گلومرولی می باشد((Keush et a; 1998 & Bennish et al ; 1998.

توکسینی مشابه آن را اشرشیا کولی تولید می کند به نام های 1Stx و 2Stx که تا 98 درصد تشابه دارند. حساسیت سلولهای اندوتلیال کلیه انسان به stx در مقایسه با 1 Stx تا 1000 برابر بیشتر است. به همین دلیل عامل اصلی بیماری خون ادراری HUS معرفی گردیده است. سمیّت و قدرت ایمنی زایی شیگا توکسین Stx بسیار بالا می باشد، به شکلی که حدود 28 نانو گرم از آن باعث مرگ یک موش می شود و همچنین به دلیل داشتن قدرت آنتی ژنی بالا دارای پتانسیل ایجاد پاسخ ایمنی و تولید آنتی بادی علیه توکسین در بدن بیمار می شود. رسپتور زیر واحد B به رسپتور سطحیGb3 متصل شده است و تشکیل یک کمپلکس را می دهد(2003Goguen et al;).

ارگانیسم های شیگلا به سلول های اپیتلیال حمله کرده و باعث مرگ سلولی وزخم های موکوسی می گردند، که این عفونت ها در شیگلا دیسانتری تیپ1، حاد تر می باشد (Dipika et al; 2004).

ارگانیسم های شیگلا به ندرت به سیستم گردش خون حمله می کنند. یکی از مشخصه های بارز دیسانتری باسیلی این است که اختلال تنفسی در سلول به وجود می آید و نتیجه آن نکروز اپیتلیوم کولونیک می شود. از علائمی که می تواند توجیه کننده این موضوع باشد می توان به افزایش سطوح پیروات و کاهش لاکتات وATP اشاره کرد((Bhargava et al;1995 که همه این عوارض در دیسانتری تیپ 1 بیشتر است. شیگلا خاصیت حمله به اریتروسیت ها را دارد. آنها پس از حمله به اریتروسیت ها واکوئل ها ی موجود در فاگوسیت ها را لیز می کنند سپس به سلول های سیتوپلاسم حمله می کنند و آنها را از بین می برند. شیگلا طی یک فرایند فاگو سیتوز به سلول های اپیتلیال حمله می کند. زمانی که شیگلا با سلول ها برخورد می کنند و آنها را آلوده می کنند باعث می شود تغییراتی در اکتین سیتوپلاسم ها به وجود آید، فیلامنت های اکتین میوزین سبب احاطه شدن و مستحکم کردن باکتری می شود. در مرحله بعدی واکوئل ها توسط پلاسمید های باکتری لیز شده و سر انجام باکتری شیگلا به داخل سلول میزبان رها می شود (.(High et al;1992 انتشار سلول به سلول زمانی که شیگلا در حال آلوده کردن سیتوپلاسم می باشد از طریق تشکیل یک موتور سیتواسکلتی صورت می گیرد (Bennich et al ; 1998 ).

سویه های فاقد این خاصیت نیز پاتوژن می باشند. اگزوتوکسین ها مسئول ایجاد علائم بالینی دیسانتری باسیلیمثل تب، خستگی و بدن درد هستند. از آنجایی که مخاط روده کوچک در انسان ها مورد تهاجم قرار نمی گیرد، می توان نتیجه گرفت که این میکروارگانیسم در حین عبور از روده کوچک می تواند توکسین ترشح کند. در پاسخ به عفونت چهار پروتئین سبب بر انگیحتن پاسخ های ایمنی (آنتی بادی) می شوند که به نام های ، IPa(70KDa)، IPB(62KDa)، IPC(43KDa) ، IPD(38KDa) می با شد ، پروتئینIpa (آنتیژنهایپلاسمیدیمهاجم ( درغشایباکتریهایقراردارندودررونداندوسیتوزباکترینقشیدارند((Islamd D et al ;1997,.

IpaB یکیازفاکتورهایبیماریزایشیگلاست،وزنمولکولیآن57کیلودالتونواندازهژنآن1743نوکلئوتیدحاوی580اسید آمینه است(Buysse JM, et al ; 1987) . اینژنیکپروتئینترشحیتولیدمیکندودرسیتوپلاسم ماکروفاژهایآلودهقرارمیگیرد. IpaB جهتالقاءآپپتوزدرماکروفاژهاکافیاستواینکاررابااتصالمستقیمبهترکیباساسیماشینمرگ IL-1b انجاممیدهد(Guichon A et al ;2001) . سیستم ترشحی نوع 3 سبب ترشح این چهار نوع پروتئین به داخل سلول های اپیتلیال شده و سبب تغیراتی در غشا و وارد شدن باکتری به روش فاگوسیتوز می شود(Ranjbar et al; 2012).

1-2-4 توصیف علائم بیماری ناشی از عفونت با شیگلا

دیسانتری باسیلی یا شیگلوز یکعفونترودهایاستکهعلائمآناز یکاسهالآبکیتا یکالتهابشدیدگستردهاست.اینبیماریبادردهایشدیدشکمی،تب، مدفوعحاویخونوموکوسشناختهمیشود. اینبیماریجزدر مواردیکهبیمارداراینقصایمنیباشدیادرمانهایاولیهپزشکیدر دسترسنباشد،معمولاخودمحدودشوندهاستBennish et al; 1991) ). در برخی از موارد ممکن است نشانه هایی از بیماری دیده نشود اما در افراد دیگر دیسانتری ملایم و حاد به همراه تب کرمپ شکمی و درد ایجاد کند. همچنین در کودکان می تواند تب خیلی بالا، تشنج و سوء تغذیه ایجاد کند. شیگلا سونئی اسهال خونی ملایم را ایجاد می کند، شیگلا فلکسنری و شیگلا دیسانتریه، اسهال خونی حاد را ایجاد می کنند. شیگلوزیس ممکن است همراه با یک و یا چند عوارض مرگ بار باشد (Barrett et al; 1970). درمیان50سروتایپوساب تایپشیگلا،شیگلادیسانتریتیپ1بهشدتبیماریزااست.شیوع اسهالخونیناشیازشیگلادیسانتریهتیپیکدرنواحیپرجمعیتوبا بهداشتپائینبالاتراست.اینتنهاسابتایپایجادکننده اپیدمیوپاندمیدرجهاناست (McKenzie et al; 2008 ). در کودکان تب بالا، تشنج، آرتریت، پاره شدگی روده بزرگ، خونریزی، انتروپاتی و دفع پروتئین را ایجاد می کند (Bennish et al; 1991) . واکنش لوکوموئید (تعداد WBC>5000) و سندروم همولیتیک اورمیک (خونریزی مویرگ ها، از کار افتادن کلیه ها ) در شیگلا دیسانتری تیپ 1 ممکن است مرگ بار باشد (Dipika et al; 2004). در بیماران که مبتلا بهHIV هستند با علائمی مانند سپتی سمیّ، ایجاد سوراخ در روده کوچک، سمیت در روده بزرگ، دهیدراسیون، کمبود سدیم، عفونت در مغز، ذات الریه،و ادرار خونی همراه است. همچنین دیسانتری باسیلی به همراه دیسانتری مداوم می تواند آسیب به روده بزند و باعث دفع پروتئین و سو ء تغذیه شود(Bennish et al; 1991) .

1-2-5 اپیدمیولوژی

دیسانتری باسیلی بطور شایعی مربوط به کودکان بوده بطوری که هفتاد درصد از موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. دیسانتری باسیلی از طریق دهانی - مدفوعی انتقال می یابد. این بیماری در مرحله اول از طریق دستان آلوده افراد و به میزان کمتر از طریق آب یا غذای آلوده منتقل می شود ;2008)Ranjbar et al). شیگلا دیسانتریه در کشور های در حال توسعه شیوع بیشتری دارد ولی شیگلا فلکسنری A2در کشور های صنعتی میزان مرگ و میر بالاتری را به خود اختصاص داده است. درموردشیوعشیگلادرایرانآمار رسمیموجودنیستامابنابرنتایج برخی تحقیقاتدرتهران،شیگلاسونئیگونه غالبجداشدهازبیمارناست; 2003 )Ranjbar et al). دیسانتری باسیلی شدیداً مسری بوده و انسان میزبان اصلی سویه های شیگلا می باشد. این ارگانیسم مقاوم به اسید بوده و به راحتی می تواند از معده آن عبور کند. راه های شایع انتقال آن انسان به انسان و از آب و غذای آلوده می باشد. کارکنان فراوری های غذای آلوده می توانند بیماری را انتقال دهند. گاهی چیدن و مصرف سبزیجات و میوه های خام و مصرف آنها که با فاضلاب و کود های حیوانی رشد کرده اند می تواند ایجاد آلودگی کند. مگس ها می توانند با نشستن بر روی مدفوع آلوده و انتقال آن به غذای انسان بیماری را انتقال دهند. شستن و استحمام کردن در برکه ها که در هند رایج است نیز می تواند باعث انتقال بیماری در صورت آلوده بودن آب با مدفوع فرد مبتلا گردد. این بیماری در مکان های شلوغ و فقیر که بهداشت کم می باشد شایع تر می باشد با این وجود توریست هایی که به مناطق آلوده سفر کرده اند نیز می توانند مبتلا شوند(WHO; 2001 ). انسان تنها میزبان شیگلا می باشند. دوز عفونی آن کمتر از 200 سلول باکتری می باشد و انتقال آن در مناطق شلوغ با بهداشت ضعیف آسان تر می باشد(Levine et al 1991 & Dupont et al; 1989 )

این بیماری در کشور های در حال توسعه، یک بیماری شایع در کودکان می باشد اما در کشور های توسعه یافته اکثراً در مهد کودک ها، زندان ها، پادگانها، و در نواحی که سرخ پوستان زندگی می کنند وجود دارد Bennish; 1998 ) .(Keusch & . با این وجود این بیماری از طریق غذا در افرادی که در معرض خطر نیستند هم انتقال می یابد. مسیر انتقال آن مدفوعی دهانی می باشد که از طریق آب، غذا، و انسان به انسان نیز منتقل می شود و شستن دستان آلوده میزان انتقال را کاهش می دهد. در برخی از مناطق میزان شیوع در فصل موسمی افزایش پیدا می کند شاید به دلیل افزایش آلودگی مدفوعی آب آشامیدنی باشد. همچنین شواهدی موجود است که مگس خانگی نیز عامل انتقال می باشد(Levine et al; 1991 & 1993 ).

1-2-6 تشخیص آزمایشگاهی

شیگلوز با بررسی شکلی باکتری، بررسی میزان اسید مدفوع، کشت مدفوع، حضور زیاد لکوسیت، تست های بیوشیمیایی همچنین توجه به علائم بیماری مانند کاهش آب بدن، قابل تشخیص می باشد. تشخیص اختصاصی شیگلا در نمونه مدفوع بستگی به کشت صحیح و انتقال درست به آزمایشگاه دارد. نمونه های تازه مدفوع قبل از آغاز درمان برای انجام تست های میکروبیولوژی در نظر گرفته می شوند. زیرا احتمال زنده بودن آنها زیاد است. برای کشت میکروبیولوژی، مدفوع تازه نسبت به سواب رکتال ارجح است، زیرا میکروب زنده در آن کمتر وجود دارد. نمونه هایی که فوراً کشت داده نشوند باید در محیط انتقالی گلیسرول سالین بافردار قرار گیرند. محیط کری بلر(Cary blair) پس از آن در انتخاب دوم قرار دارد. کشت پلیت در کنار بالین بیمار بهترین حالت برای ایزوله کردن شیگلا از بیماری دیسانتری است(Albert et al ; 1992).

1-2-6-1 کشت

محیط های کشتی که می توانند از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری کنند مناسب می باشند مثل: مکانکی، SS آگار و XLD. برای جداسازی شیگلا از نمونه های کلینیکی مورد نیاز باید پس انکوباسیون 37 درجه آن را بررسی کرد. کلنی های لاکتوز منفی و کدر بر روی محیط مکانکی و بر روی محیط XLD به رنگ صورتی پدید می آید (Shears et al; 1996 ).

آزمایشبایدبررویمدفوعتازهانجامشود. نمونههابایددرمرحلهحادبیماریوقبلازاستفادهازآنتیبیوتیکجمعآوریشوند. بعدازجمعآوریهرچهسریع ترکشتدادهشوند، حداکثرطی2ساعتودرغیراینصورتیخچالگذاریشوندویابهمحیط نگه دارندهمناسبانتقالدادهشوند. بهترینمحیطبرایزندهماندنشیگلاهامحیطبافرگلیسرلفسفات می باشد که به خصوصاگراینمحیطهادریخچالیافریزرنگهداریشوند. در محیطنوترینتآگاروبلادآگارکلنیهایصاف،براقیابیرنگوماتبهقطر 2 تا 3 میلی متر شبیه سالمونلاایجادمینماید .کلنیهایشیگلاسونئیکمیبزرگتروتیرهترازسایرشیگلاها است. اشکال کوکو باسیل در کشت های جوان مشاهده می شود. این باکتری با اینکه بی هوازی اختیاری می باشد در محیط هوازی بهترین رشد را دارد. کلنی های آن محدب گرد و حاشیه مشخص دارد و طی 24 ساعت قطر کلنی ها حدوداً 2 میلی متر می باشد (Brooks et al; 2004).

1-2-6-2 تست های بیوشیمیایی

الف) تخمیرکربوهیدرات ها: اغلبسویههاقند راباتولیداسیدوبدونایجادگاز، تخمیرمیکنند. اگرچهبعضیازسویهها مانندشیگلا فلکسنریسروتایپ Manchester واریتههای6وNewcastle و شیگلابوئیدیسروتایپ14و13گازتولید میکنند. همهسویههاگلوکزراتخمیرمیکنند .اکثرسویههاقادربهتخمیرلاکتوزدرمدت 24ساعتیاطولانیتر نمیباشند هرچنداکثرسویههایشیگلاسونئیلاکتوزرابعدازچندروزتخمیرکردهواسیدتولیدمی نمایند.

ب) تست :ONPG این تست برای گونه های C، A و B معمولاًمنفیاست،اماشیگلادیسانتری تیپ1وشیگلابوئیدی9وفلکسنری 2a وهمهگروه هایسویههایشیگلاسونئی ONPG مثبت اند.

ج) تخمیرمانیتول: سویههایگروه A مانیتولراتخمیرنمیکنند وبراساس اینتستاز گروههای D و C ، B که اغلب مانیتول را تخمیر می کنند، متمایز می شوند.

د) تولیداندول: شیگلادیسانتریسروتایپ1وشیگلافلکسنریسروتایپ6وشیگلاسونئیمعمولاًاندولمنفیاند. سایرسویهها نسبتبهاینواکنشمتفاوتند.

ه) تستکاتالاز: شیگلاهامانندسایرانتروباکتریاسههاکاتالازمثبتاند .اماشیگلادیسانتریسروتایپ1وتعدادکمیاز سویههایشیگلافلکسنری کاتالاز منفی هستند. اوره از منفی، متیل رد مثبت، سیترات منفی از دیگر واکنش های بیوشیمیایی آن می باشند.

1-2-6-3 روش های مولکولی(PCR )

می توان از روش های سریع جهت تشخیص باکتری از پروبهای ژنی و یا پرایمر های ساخته شده مربوطه برای PCR استفاده کرد. (Bauer et al ; 1966 ) بیشتر روش های PCR بسیار حساس و اختصاصی می باشد، و نسبت به تکنیک های کشت و احتمال این که خطا داشته باشد بسیار کمتر می باشند، علاوه بر آن، در بیشتر سویه های شیگلا حذف ژنی به مقدار کمی وجود دارد، به همین دلیل PCRمستقیم مدفوع ارجح تر از تکنیک هیبریداسیون DNA است که باید چندین بار در آن نمونه را کشت داد می باشد.

لازم به ذکر است که بیشتر روش های PCR برای تشخیص شیگلا بر علیه ژن (ial) یا ژن(ipaH) طراحی شده است که در E. coli نیز وجود دارد (Dutta et al; 2001). استفاده از پرایمر های اختصاصی IS630 به همراه پرایمر اختصاصی سروتایپ برای ژنهای rfc با مولتی پلکس PCR برای تشخیص سروتایپ های مختلف شیگلا مفید می باشد Houng et al; 1997)).

1-2-7 کنترل و پیشگیری

1-2-7-1 بهداشت فردی

روش های کنترل و پیشگیری شامل تهیه منابع آبی بهداشتی و امکان تهیه غذای بهداشتی و همچنین رعایت بهداشت فردی می باشد. شستن صحیح دست ها با صابون (Dipika et al; 2004) تاکید می شود. دست ها باید پیش از خوردن غذا به صورت صحیح شسته شوند و این مستلزم آموزش می باشد.

1-2-7-2 واکسن ها

روشهایزیادیبرایتولیدواکسنبرعلیهشیگلابکار گرفتهشدهاستازآنجملهواکسنهایزندهضعیفشده(Phalipon et al; 1995 )، به عنوان مثال واکسن ادغام شده LPS شیگلا سونئی که سمیت آن از بین برده شده است با پروتئین حامل سودوموناس آئروژینوزا و همچنین واکسن پروتئوزومی شیگلا که از راه بینی مورد استفاده قرار می گیرد، که تشکیل شده ازاتصال غیر کوالانی LPS شیگلا با پروتئین B نایسریا مننژیتیدیس. از میان واکسن های احتمالی دیگر ترکیبی از سویه زنده ضعیف شده شیگلا فلکسنری a2سویه CVD120 و شیگلا دیسانتری تیپ 1 سویه CVD1253 ایمونوژن و مطمئن می باشد. واکسن سویه زنده ضعیف شده شیگلا فلکسنری a2 سویه SC602 با موفقیت فاز 1و 2 کلینیکی در آمریکا و بنگلادش را گذرانده است (Sur et al; 2003 ). به دلیل مشکلات در روش های پیشگیری و کنترل شیگلا دیسانتر ی تیپ 1 و قابلیت آنها در ایجاد اپیدمی های شدید، تهیه واکسن ایمن و موثر علیه شیگلا دیسانتری تیپ ا و شیگلا فلکسزی a2 بسیار با اهمیّت است.WHO برنامه تهیه واکسن شیگلوز خود را بر همین اساس اولویت داده است. حفاظت علیه عفونت های کلینیکی راه کاری منطقی علیه دیسانتری باسیلی است. از آنجایی که شیگلوزیس حداقل از سه سویه ایجاد می گردد، یک واکسن سه ظرفیتی می تواند موثر باشد. در حال حاضر چندین کاندید واکسن وجود دارد. تمامیاینروشهایداراینواقصیاست.برای مثال،در واکسنزندهضعیفشده، بیماری زاباقیمانده و استفادهازاینروشرابامحدودیتروبروساخته است (McKenzie et al; 2008) .تلاشبرایساختیکواکسنموثرهنوزادامهدارد. یکروشتغییریافتهتهیهواکسنبرعلیهشیگلااستفادهازکمپلکس(Invaplex) IpaC, LPS IpaB, استوبهعنوانیکواکسنتجویزیازراه بینیدرمدلهایکوچکحیوانیکاربرددارد.باتوجهبهپاسخمناسبیکهسیستمایمنیبهآنتیژنهای IpaB , IpaC LPS برایواردشدنبهسلول میزبان ایجادمیکند، امیدبرایتولیدواکسنبهاینآنتیژنهااست. برایدر دستداشتنهریکازاینآنتیژنهایکیازروش هااستخراجژنمربوطه وکلونآنهادروکتورمناسباست. باآزمایشبررویمدلحیوانیمی توانایمنیزاییآنرانیزبررسیودرصورتایمنوژنبودنبهعنوانیک جزءبرایواکسنهاینوترکیباستفادهنمود.

1-2-8 درمان

استفاده صحیح از آنتی بیوتیک روند بهبودی شیگلوز را تسریع می کند، و دفع پاتوژن در مدفوع را کم کرده همچنین از بروز عوارض جلوگیری می کند. استفاده از آنتی بیوتیک ها باید بر اساس الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی صورت گیرد. در حال حاضر آنتی بیوتیک های انتخابی، نورفلوکسازین (mg400) و سیپروفلوکسازین (mg500) یا اوفلوکسازین) mg200( برای مصرف 3 تا 5 روز مدنظر می باشند. این داروها برای زنان باردار توصیه نمی شوند (Dipika et al; 2004). با وجود این که دهیدراسیون علامت شایعی در دیسانتری باسیلی نیست اما اگر دیده شود یا مدفوع آبکی شود به بیماران باید طبق توصیه WHO،ORS داده شود. در دهیدراسیون حاد، تزریقات مایع درون رگی که معمولا رینگر لاکتات است، توصیه می شود. مثل عفونت های دیگر اسهالی، درمان اسهال خونی شامل مصرف آنتی بیوتیک و احیایی آب بدن می باشد. مشکل از دست رفتن آب بدن در این بیماری از اهمیت چندانی برخوردار نیست. طول دوره در این بیماری بسیار پر اهمیّت است، بنابراین درمان صحیح دیسانتری باسیلی وابسته به تاثیر آنتی بیوتیک ها می باشد. هر دو آنتی بیوتیک (سولفونامید ها وتتراسایکلین ها) مؤثر می باشند،اما به سرعت نسبت به آنها در باکتری مقاومت ایجاد می شود. آمپی سیلین و کوتریموکسازول در ابتدا مؤثر واقع شده اما متأسفانه چندین مورد مقاومت در جهان گزارش شد، بعد از آن کینولونی به نام نالیدیکسیک اسید معرفی شده که در ابتدا نتایج بسیار حیرت آوری را نشان داد ولی نسبت به این دارو نیز مقاومتهایی گزارش شد(Munshi et al; 1992). نگرانی در استفاده از فلوروکینولون ها در کودکان به دلیل ایجاد آرتروپاتی وجود دارد(Salam & Bennish; 1986). فلوروکینولون های جدید مثل نورفلوکسازین و سیپروفلوکسازین باعث ریشه کن شدن بسیاری از میکروارگانیسم ها می شوند(Rogerie et al; 1986 ). این آنتی بیوتیک ها گران بوده و اگر به طور وسیعی به کار گرفته شوند هزینه بر میباشند، بنابر این انتخاب دارویی محدود می باشد (Hoge et al; 1998). چندین آنتی بیوتیک مثل سفالوسپورین های نسل اول و جنتامایسین ها وجود دارند که در آزمایشگاه باکتریها به آنها حساسیت نشان می دهند در حالیکه در کلینیک از خود نسبت به آنها مقاومت نشان داده اند. استفاده از آنتی بیوتیک هایی که باکتری نسبت به آن مقاوم یا بی اثر باشد، می تواند دارای ریسک باشد. علاوه بر آن خطر ایجاد عوارض احتمالی را نیز افزایش می دهد و ممکن است فلور نرمال روده کوچک را بر هم بزند. شواهدی وجود دارد که نشان میدهد فلور نرمال روده کوچک با عوامل عفونی شیگلا رقابت می کنند. بنابراین یک آنتی بیوتیک بی اثر می تواند شدت بیماری را افزایش دهد زیرا ممکن است برروی شیگلا به صورت انتخابی عمل کند. در حال حاضر فلوروکینولون ها نظیر افلوکساسین و سیپروفلوکساسین و سفالوسپورین های با طیف اثر گسترده نظیر سفتریاکسون درمان انتخابی دیسانتری باسیلی به شمار می روند. هم اکنون در نقاطی از جهان سویه هایی هر چند نادر با مقاومت سطح بالا به سفالوسپورین های نسل سوم و فلوروکینولون ها نیز گزارش شده است.

1-2-8-1 مقاومت دارویی و اهمیت آن در شیگلا

سویههایباکتریشیگلابهمروربهاغلبآنتیبیوتیکهایرایج وارزانقیمتمقاومشدهاند ودرمانهایآنتیبیوتیکیراباشکستروبه رو کردهاند( Phalipon et al; 2003 & Sansonetti et al; 2003).

بهنظرمی رسد تنوعفراوانیالگوهایژنتیکیموجوددریکگونهشیگلا مانندشیگلاسونئیدریککشور،منجربهبروزالگوهای متنوعمقاومتآنتی بیوتیکیمی شود(et al;1987Velayati). عواملی همچون مصرف بی رویه، غیر منطقی و غیر اصولی آنتی بیوتیک ها بدون توجه به الگوهای مقاومتی میکروارگانیسم نیز می تواند باعث ظهور سویه های مقاوم شود. نکته اساسی در ظهور و انتشار مقاومت در بین باکتری ها این است که به وجود آمدن سویه های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک ها نسبت مستقیم با مقدار استفاده از آنتی بیوتیک دارد. این مسئله با مشاهده افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی در بیمارستان ها در مقایسه با بخش های که مراقبت ویژه دارند اثبات شده است. از عوامل به وجود آورنده مقاومت، می توان به تجویز غیر اصولی آنتی بیوتیک، مصرف آنتی بیوتیک ها در زمان خود درمانی، عدم اطلاع رسانی کافی جهت اطلاع بیماران نسبت به مصرف داروها و نبود فرهنگ مناسب جهت مصرف آنتی بیوتیک ها در کشور های در حال توسعه اشاره کرد. تتراسایکلین ها به طور وسیعی در دهه 1940 جهت درمان دیسانتری باسیلی استفاده شدند با این وجود، مقاومت به تتراسایکلین ها به وجود آمد. در سال 1953 اولین مورد مقاومت به تتراسایکلین در شیگلا دیسانتری گزارش شد. بیشتر عوامل مقاومت به تتراسایکلین ها ژنتیکی هستند، که دارای ژن های ساختاری و تنظیمی می باشند که در ایجاد مقاومت نقش دارند(Dipika et al; 2004). در همان دهه1940 سولفونامیدها برای اولین بار معرفی شدند، که تمام سویه های شیگلا به این دارو حساس بودند و باعث شد این دارو به عنوان انتخاب اول درمانی استفاده شود. به علت بی اثر شدن سولفونامید ها در اواخر دهه 1940 میلادی، تتراسایکلین در کنار کلرامفنیکل برای درمان دیسانتری باسیلی توصیه شد، سپس مقاومت به داروی پیشنهادی دوم نیز دیده شد و داروهای پیشنهادی بعدی آمپی سیلین و کوتریموکسازول بودند (Ross et al ;1972 ). با این وجود در دهه 1980 در شرق هند شیگلا دیسانتری تیپ 1 به این دارو نیز مقاومت نشان داد. در نهایت در اواخر دهه 1980 فلوروکینولون ها (سیپروفلوکسازین، نورفلوکسازین و اوفلوکسازین) پیشنهاد گردیدند که بسیار مؤثر بودند. اما در سال های اخیر نیز گزارش هایی مبنی بر مقاومت به این دارو بدست آمده است. چنینمسئلهایهماکنوندرکشورهایهمسایهایرانبهخصوصپاکستانوبنگلادش باعثشدهتاازکینولونهایجدیدبرایدرمانابتدایی شیگلااستفادهنمایند(Cleary et al; 2004 ) .

کینولون ها داروهای بسیار مفیدی برای درمان دیسانتری باسیلی تیپ 1 می باشند. مقاومت به این گروه از داروها توسط سویه های دیسانتری باسیلی، به دلیل وجود موتاسیون رخ می دهد(Dipika et al; 2004).

1-2-8-2 تاریخچهاستفاده از کینولون ها و فلوروکینولون ها به عنوان آنتی بیوتیک

فلورو کینولون ها و کینولون ها گروه مهمی از آنتی بیوتیک ها هستند که به طور وسیعی در درمان بیماری های عفونی مختلف در بالغین به کار می روند. به دلیل طیف وسیع اثر آنها، جذب مناسب بافتی و راه های استفاده آسان مورد استفاده قرار می گیرند، با این وجود استفاده از فلوروکینولون ها به دلیل ایجاد سمیت مفصلی در اطفال محدود تر بوده است. فلوروکینولون ها به طور موفقیت آمیزی در اطفال دارای نقص ایمنی و همچنین دارای عفونت های گرم منفی مقاوم به دارو ( شامل عفونت های نوزادی و عفونت های گوارشی مقاوم به دارو توسط سالمونلا و شیگلا ) مفید واقع می گردند. کینولون ها در سال 1962 توسط George Y Lesher تولید شدند. نالیدیکسیک اسید، اولین کینولونی بود که بکار گیری آن در کودکان تائید و ترکیبی غیر فلوری است که درهمان سال (1962) به بازار آمد و هنوز مورد استفاده قرار می گیرد. زمانی که اتم فلور در موقعییت 6 آن قرار می گیرد، فعالیت ضد میکروبی آن را بسیار زیاد می کند که به این ترکیب فلوروکینولون گفته می شود. فلوروکینولون ها در اوایل دهه 1980 تولید شدند، پفلوکسازین، سیپروفلوکسازین، افلوکسازین، از انواع مختلف آن می باشند. فلوروکینولون های جدید تر در اواخر دهه 1990 به صورت Invitro تولید شدند و فعالیت آنها در مقابل پاتوژن های گرم منفی مورد بررسی قرار گرفت. تمامی فلوروکینولون ها فعالیت بسیار خوبی در مقابل باسیل های گرم منفی هوازی دارند و فلوروکینولون های جدید در مقایسه با فلوروکینولون های قبلی در مقابل کوکسی های گرم مثبت نیز مؤثر واقع می شوند. فلوروکینولون های جدیدتر فعالیت کمتری در مقابل سودوموناس آئروژینوزا در مقایسه با سیپرو فلوکسازین ها دارند، ولی فعالیت بیشتری نسبت به استافیلوکوکوس های مقاوم به متی سیلین و استافیلوکوکوس های کواکولاز منفی دارند. اثر آنها در برابر انتروکوکوس ها و لیستریا مونوسایتوژنز از نظر کلینیکی مورد برسی قرار نگرفته است و سویه های هموفیلوس آنفولانزا، مایکوپلاسما پنومونیا، کلامیدیا پنومونیا، لژیونلا پنومونیا، به طور یکسان به آن مقاومت نشان داده اند. تنها تروافلوکسازین از تمامی کینولون ها در مقابل باکتری های بی هوازی مقاوم اثر پذیری خوبی دارد (MacDougall et . al ; 2004 ) .

به کار گیری ناشیانه از فلوروکینولون ها در اطفال باعث افزایش مقاومت می شود. میزان مقاومت به فلوروکینولون ها در هر نوع بیماری اکتسابی از جامعه و یا عفونت های بیمارستانی در بالغین در حال افزایش می باشد و این پدیده را نباید زمانی که از این ترکیبات در کودکان استفاده می شود، فراموش کرد. فعالیت خوب آنها در مقابل پاتوژن های بیماری زا باعث افزایش ریسک انتشار مقاومت به فلوروکینولون ها می شود. اهداف اولیه فلورو کینولون ها توپو ایزومر های باکتریایی هستند که گروهی از آنزیم های ضروری در پایداری DNA باکتری می باشد (MacDougall et . al ; 2005 ).

1-2-8-3 کاربرد فلوروکینولون ها در درمان عفونت های انسانی

فلوروکینولون ها به خوبی در موارد سخت عفونت گوش میانی تاثیر درمانی دارند. گونه های باکتریایی با حساسیت کمتر به فلوروکینولون ها در جهان توصیف شده اند. هیچ گونه اختلال قلبی و عروقی با مصرف فلوروکینولون ها در اطفال مشاهده نگردیده است. جذب این آنتی بیوتیک ها از طریق غشا خارجی با جا به جایی کاتیون های دوظرفیتی ترغیب می گردد و این ترغیب به وسیله ناپایدار شدن غشا و ورود بیشتر آنتی بیوتیک ها به درون غشا کمک می کند، به استثناء سیستیک فیبروزیس و عفونت های خطر ناک. استفاده از فلوروکینولون ها در درمان مننژیت های ارگانیسم های گرم منفی در نوزادان و عفونت های ناشی از گونه های سالمونلا و شیگلا باید به کار رود. فلوروکینولون های جدیدتر توانسته اند خصوصیات چون فراهمی زیستی، کلیرانس، متابولیسم، نیمه‌عمر، حجم توزیع و اثر عبور اوّل خود را در مقایسه با قبل از نظر نیمه عمر، سطح بالاتر کشندگی، حجم انتشار، جذب بافتی و تسهیل در مصرف تقویت کنند. اطلاعات در مورد اثر بدن بر روی دارو فلوروکینولون ها در اطفال محدود می باشد، زیرا بیشتر مطالعات اثر بدن بر روی دارو بر روی افراد بزرگتر مبتلا به بیماریهای عفونی انجام گرفته است. این مسئله باعث به کارگیری دوز های بالاتر از معمول در اطفال شده است ( Capparelli et al; 2005 ). Capparelli و همکارانش گزارش کردند که جذب و دفع گاتیفلوکسازین در اطفال در مقایسه با بیماران بالغ سریع تر می باشد. Capparelli et al ; 2005 )). همچنین غلظت لووفلوکسازین در مایع گوش میانی به طور سریع با افزایش در پلاسمای خون همراه است. به عنوان مثال، نالیدیکسیک اسید علیه اغلب باکتری های گرم منفی اثر باکتریوسایدی دارد ولی فعالیت ذاتی آن محدود می باشد. کینولون ها بعد از تجویز خوراکی به خوبی جذب شده و به طور وسیعی در بدن انتشار می یابند. قسمت عمده دارو ها در بدن بدون تغیر وارد ادرار می شوند. 40درصد از دوز خوراکی نورفلوکسازین وارد خون می شود و بقیه آن از طریق صفرا دفع می گردد. تقریبا تمامی دوز خوراکی نالیدیکسیک اسید از راه خوراکی جذب می شود و 93 تا 97 درصد آن به پروتئین های پلاسما وصل می شوند. در بدن نالیدیکسیک اسید در یک متابولیت فعال به هیدرو نالیدیکسیک اسید تبدیل می شود و از طریق ادرار دفع می شود. مصرف اصلی فلوروکینولون ها در کودکان باید در عفونت های خطرناک و یا در مواردی که درمان آنتی بیوتیکی روتین موثر واقع نمی شود توصیه شود. سیپروفلوکسازین خوراکی به همراه بتا لاکتام ها و آمینوگلیکوزید ها به صورت خوراکی مؤثرند، اما نیاز به بستری شدن در بیمارستان دارند، ولی ازآنجایی فلوروکینولون ها نیاز به بستری شدن در بیمارستان را از بین می برند از آن استفاده می کنند(O’Donnell et al; 2004). با این که فلوروکینولون ها امروزه در خط اول درمان بیماری های دارای سیستم ایمنی سرکوب شده و یا کودکان سرطانی در حال انجام شیمی درمانی به کار نمی رود اما مصرف خوراکی،احتمال بستری شدن کودکان دارای ریسک کم را کاهش می دهد(O’Donnell et al; 2004)

بروز مقاومت های آنتی بیوتیکی در کودکان در بیماری های عفونت دستگاه ادراری و گوش میانی باعث شد تا مصرف کینولون ها ( نالیدیکسیک اسید) پیشنهاد شود(Abelson et al; 2004 ). فلوروکینولون ها جایگاهی در درمان AMO(عفونت گوش میانی ) عادی ندارند، اما در میان AMO مقاوم، سایر آنتی بیوتیک ها مورد استفاده قرار می گیرند، که عبارتند از گاتیفلوکسازین، لووفلوکسازین. عوارض در طول درمان که نشانه ای از سمیّت مفصلی، سمیت کبدی و یا CNS است در کودکان دیده نشده است. پس در نتیجه مصرف فلوروکینولون ها باید با دقت انتخاب شود. این داروها در حال حاضر در اطفال به عنوان خط دوم درمان آنتی بیوتیکی قرار دارند و بیشتر زمانی مورد استفاده قرار می گیرند که درمان های اولیه دارو ناموفق باشد. به جزء سیستیک فیبروزیس و عفونت های خطرناک دیگر، که مصرف آنها به عنوان خط اول درمان آنتی بیوتیکی مورد استفاده قرار گیرد، و همچنین در مننژیت نوزادی گرم منفی، و سالمونلا و شیگلا در خط اول درمانی قرار دارند. افزایش در مصرف این دارو باعث افزایش در روند پیدایش سویه های مقاوم به فلوروکینولون ها می گردد. مصرف کینولون در کودکان به دلیل بروز سمیّت مفاصل در حیوانات در حال رشد، محدودتر شده است. این ترکیبات در طب اطفال فقط در موارد ایجاد مقاومت در خط دوم دارویی قرار می گیرند به جز موارد خاص.

1-2-8-4 مکانیسم عمل کینولون ها

اغلب کینولون ها وزن مولکولی کم داشته و آب دوست می باشند. این صفات نشان می دهند که این آنتی بیوتیک ها می توانند از کانال های پورینی وارد غشا شوند. جذب این آنتی بیوتیک ها از طریق غشا خارجی با جا به جایی کاتیون های دوظرفیتی ترغیب می گردد و این ترغیب به وسیله ناپایدار شدن غشا به ورود بیشتر آنتی بیوتیک ها به درون غشا کمک می کند. اثر کینولون ها بر روی DNAجیراز و توپوایزومراز IV می باشد، که هر دوی آنها برای رشد و تقسیم سلول لازم می باشند(Morosini et al; 2003). DNAجیراز از دو زیر واحد gyrAو gyrB تشکیل شده و کد گذاری می شوند و توپو ایزومراز IV از دو زیر واحد ParE و ParC تشکیل شده و کد گذاری می شوند(Drlica & Zhao; 1997). کینولون ها در باکتری های گرم مثبت معمولاً بر روی توپوایزومرازIVو در باکتری های گرم منفی رویDNA جیراز اثر بخشی دارد، همان طوری که گفته شد مکانیسم اغلب این داروها مهار همانند سازی می باشد(Urussel et al; 1990). در این حالت دارو با اتصال به محلی مابین DNA جیراز و توپوایزومراز IV باعث تشکیل یک کمپلکس و تغیر ساختار فضایی می شود. با دخالت آنزیم، کمپلکس آنزیم، DNA و کینولون تشکیل می شود که باعث مهار همانند سازی می گردد.(Hawkey et al; 2003) در برخی از موارد کینولون ها باعث آزاد شدن دو انتهای DNA می شوند. این عمل در حالت درمان با مصرف زیاد یا دوز مصرفی بالا در درمان با فلوروکینولون ها رخ می دهد .(Drlica & Zhao, 1997)

درمان دیسانتری باسیلی با آنتی بیوتیک های متفاوتی مورد بررسی قرار گرفته است و انتقال مقاومت می تواند درون یک کلنی باکتریایی خاص صورت گیرد(Dutta S et al; 2003). انتقال افقی شاخص های مقاومت، توسط پلاسمید انجام می گیرد (از طریق کانجوگیشن توسط ترانسپوزون و یا کروموزوم نیز رخ می دهد)(Dipika et al; 2004) .

1-2-8-4-1 آنزیم DNA جیراز

محل این آنزیم در سیتوپلاسم سلول های باکتریایی است و یک پروتئین تترامری متشکل از دو زیرواحد B و A است که به ترتیب توسط ژنهای gyrA و gyrB کد گذاری می گردد (Threlfall et al; 2001).

1-2-8-4-1-1 نقش آنزیم DNA جیراز سلول های باکتریایی

DNA جیراز برای تکثیر DNA الزامی است. هر عاملی که سبب شود دو رشته DNA از هم جدا شود، همانند سازی را متوقف می کند. وظیفه DNA جیراز مقابله با این عمل و عدم جدا شدن 2 رشته می باشد. این عمل وابسته به ATP می باشد که توسط روشهای مختلف صورت می گیرد مثل :

الف) ایجاد پیچ وتاب خوردگی درDNA ( Champoux et al; 2001& Salerno et al; 2003).

ب) ایجاد سوپر کویل منفی: سوپر کویل مثبت جلوی همانند سازی را می گیرد. DNA جیراز با جذب سوپرکویل مثبت و تولید سوپر کویل منفی همانند سازی را تسهیل می کند. (Gained et al; 2006& Rossiter et al; 2002)

DNAجیراز، در E.coli از دو زیر واحد با اوزان مولکولی 105000 دالتون (زیر واحدA) و زیر واحد B 95000 دالتون، تشکیل شده است. زیر واحد A نقش برش دادن را دارد و محل اثر کینولون ها می باشد.

1-2-8-5 مقاومت به فلوروکینولون ها

مقاومت میکروارگانیسم ها نسبت به فلولوروکینولون ها با پیدایش موتاسیون های کروموزومی با ایجاد یک یا چندین جهش در ژن های کد کننده DNA جیراز یا توپوایزومراز IV رخ می دهد. در ارگانیسم های گرم منفی، مکانسیم مقاومت شامل یک موتاسیون اولیه در ژن gyrA می باشدet al; 2000 ) .(Petrilliدر باکتری های گرم مثبت مقاومت از طریق ایجاد موتاسیون های بیشتر در نقاط مختلف در ژن، ایجاد می شود. موتاسیون های ایجاد شده در این باکتری ها در توپوایزومراز IVنیز مشاهده می شود. با این وجود، مقاومت به یک فلوروکینولون به معنی مقاومت به تمامی آنها نمی باشد. بنابر این، نتیجه ای مورد نظر است که علیه یک موتاسیون اختصاصی باشد (Oteo et al; 1968 ). مقاومت نسبت به فلوروکینولون ها به دلیل استفاده وسیع و غیر اصولی از این آنتی بیوتیک در جامعه و همچنین به عنوان ماده افزودنی در خوراک دام ها می باشد.( Hsueh et al; 2004 )

مقاومت فلوروکینولونی در سویه های استرپتوکوکوس پنومونیا همانند دیگر باکتری ها به علت مصرف نادرست افزایش یافته است، به هر حال کودکانی که برای آنها کینولون ها به طور معمول تجویز نشده است نیاز بیشتری به مراقبت های لازم جهت ایجاد نشدن مقاومت علیه فلوروکینولون ها دارند. هم چنین درمان آنتی بیو تیکی در کودکانی که دارای پاسخ تأخیری به دارو هستند، نباید صورت گیرد زیرا جان بیمار را به خطر می اندازد(Brown et al; 2002). لازم به ذکر است که مقاومت به نالیدیکسیک اسید، سیپروفلوکسازین، و دیگر فلوروکینولون ها در گونه های مختلف شیگلا در کشور های مختلف گزاش شده است ( Niyogi et al; 2005 ) .

1-2-8-5-1 موتاسیون در ژن های شیگلا

کروموزوم باکتری ها تشکیل شده از دو DNA حلقوی که به صورت مارپیچی در آمده است که ساختار معینی ندارند و اطلاعات ژنتیکی را ذخیره می کند. یکی از این فراورده های ژنی، آنزیم DNA جیراز می باشد که محل اثر برخی از آنتی بیوتیک ها است. پستانداران آنزیم مشابهی دارند ولی با DNA جیراز باکتری ها فرق دارد که تحت تاثیر کینولون ها قرار نمی گیرد. اگرچه سنتز DNA را می توان با کینولون ها متوقف نمود ولی سایر عوامل ضد باکتریایی نیز وجود دارند که می توانند سنتز DNA را متوقف سازند. موتاسیون های مقاومت بر روی DNA جیراز و توپوایزومراز VI از نوع 2 اثر میگذارد. DNA جیراز از 2 زیر واحد gyrAو gyrBو توپوایزومراز VI از 2 زیر واحدporC و porEتشکیل شده اند. نقش DNAجیراز در شیگلا مرتبط با ایجاد سوپر کویلینگ و ایجاد مقاومت اغلب در ایجاد موتاسیون ها ی کینولون در شیگلا دیسانتری تیپ 1و تبدیل ser83 به leu است. DNA جیراز، در E.coli از دو زیر واحد با اوزان مولکولی 105000 دالتون (زیر واحدA) و زیر واحد B 95000 دالتون، تشکیل شده است. چنانچه ژن کد کننده پلی پپتید زیر واحد A، موتاسیون پیدا کند مقاومت ایجاد می شود((Hooper et al ;1987. در ارگانیسم های گرم منفی، مکانسیم مقاومت شامل یک جهش اولیه در ژن gyrA می باشد که گاهی در ژنgyrB نیز مشاهده می شود et al; 2000) .(Petrilli در مورد باکتری های گرم مثبت مقاومت از طریق ایجاد جهش های بیشتر در نقاط مختلف در ژن ایجاد می شود. در باکتری های گرم مثبت این جهش ها در توپوایزومراز IVنیز مشاهده می شود. جهش یافته گان gyrA همگی از نوع جهش های نقطه ای بوده اند و در اثر جهش به صورت انتقالی یا تقاطعی در آمده اند. این جهش ها مجاور هم بوده و در انتهای آمینو – ترمینال، زیر واحد پروتئینی gyrA در ناحیه ای نزدیک به محل اتصال DNAمی باشد. جهش در gyrB در اثر جهش انتقالی به وجود آمده است. در هر دو جهش بار الکتریکی تغیر می کند و این حالت نشان می دهد در همکنش دارو و جیراز تحت تاثیر بار الکتریکی قرار می گیرد، بدین نحو ممکن است مقاومت از کاهش اتصال کینولون ها به زیر واحد B در اثر دفع الکتروستاتیکی پدید آید. (Jeong et al; 2000).

1-2-8-5-2 تغییرات در توپوایزومراز IV

یک جایگزینی در ژن parC، در موتانت های شیگلا فلکسنری موقعیت 79(آسپارتیک اسید به آلانین) را تحت تاثیر قرار می دهد. جایگزینی های دیگری در موقعیت هایمشابه در میکروارگانیسم های گرم منفی (هموفیلوس آنفلوآنزا : آسپارتیک اسید به آسپارژین) و گرممثبت (استرپتوکوکوس پنومونیه: آسپارتیک اسید به آسپارژین) یافت شده است. اگرچه در مواردی بطور همزمان موتاسیون های دیگری نیز در gyrA و parC دیده شده است. یک موتاسیون در gyrA استافیلوکوکوس اورئوس در کدون 116 گزارش شده است که باعث تغییر اسیدآمینه آلانین به گلوتامین یا پرولین می شود. به همین ترتیب، موتاسیون هایی در کدون های دیگر استافیلوکوکوس اورئوس شرح داده شده است. به عنوان مثال: 23 (لیزین به آسپاراژین)، 69 (آسپارتیک اسید به تیروزین)، 176 (آلانین به گلایسین) یا 451 (پرولین به گلوتامین). به هر حال آن هایی که حساسیت کینولون ها را تحت تاثیر قرار می دهند هنوز شناسایی نشده اند. به نظر می رسد ارتباطی میاننقش جایگزینی اسید های آمینه درParE، ودر نتیجه افزایش مقاومت به کینولون ها در نمونه های بالینی میکروارگانیسم های گرم منفی وجود نداشته باشد. در حقیقت تنها یک جایگزینی در parE (لوسین445 به هیستیدین) در یک موتانت اشریشیا کلی مقاوم به کینولون گزارش شده است. بنظر می رسد این موتاسیونفقطدر حضور موتاسیون همزمان در gyrA، MIC کینولون ها را تحت تاثیر قرار دهد. تغییرات در این زیرواحد، در میکروارگانیسم های گرم مثبت مقاوم به کینولون ها در نمونه های بالینی و بدست آمده در آزمایشگاه نیز به اثبات رسیده است. بعنوان مثال در استرپتوکوکوس پنومونیه تغییرات این موتاسیون ها مربوط به آسپارتیک اسید 435 به آسپاراژین یا از هیستیدین 102 به تیروزین است، درحالیکه در استافیلوکوکوس اورئوس، تغییرات مربوط به پرولین 25 به هیستیدین، گلوتامین 422 به آسپارتیک اسید، آسپارتیک اسید 432 به آسپاراژین یا گلایسین، پرولین 451 به سرین یا گلوتامین و آسپاراژین 470 به آسپارتیک اسید است. با این حال ممکن است همه یا بعضی از این جایگزینی ها نقشی در افزایش مقاومت در برابر کینولون ها ایفا نکنند(Ruiz et al, 2003).

1-2-8-5-3 مقاومت وابسته به پلاسمید

در سال 1998، مقاومت پلاسمیدی کینولونی برای اولین بار در یک سویه از کلبسیلا پنومونیه در ایالات متحده آمریکا توصیف گردید. این پلاسمید (PMG252) که حاوی ژن qnrبوده، دارای وزن مولکولی kb 56 می باشد و دامنه میزبانی گسترده ای که شامل دیگر اعضای خانواده انتروباکتریاسه می باشد ، را دارا می باشد (Martinez-Martinez et al; 1998). ژن qnr یک پروتئین 218 اسیدآمینه ای با واحد های تکراری پنتاپپتیدی به نام Qnr را کد می کند که مسئول محافظت آنزیم DNA جیراز در برابر اثرات مهاری داروهای کینولونی می باشد. کاهش حساسیت به کینولون ها به دلیلوجودQnrدر سه قاره گزارش شده است.

در سال 2005 دانشمندان ژاپنی ژن qnr دیگری بنامqnrS در یک پلاسمید از سویه شیگلافلکسنری2b کشف نمودند (Hata et al; 2005)، در سال 2006 نیز در هند سومین ژن qnr، qnrB1 از سویه های کلبسیلا پنومونیه جداسازی گردید. این دو ژن 41% و 59% از اسید های آمینه ژن اصلی را دارا می باشند.

1-2-8-5-4 کاهش جذب و تغییرات در افلوکس پمپ ها

کاهش اثر جذب کینولون در عفونت ها به دو عامل بستگی دارد: 1- افزایش نفوذناپذیری باکتریایی به این عوامل ضد باکتریایی 2- بیان بیش از حد افلوکس پمپ. کینولون ها ممکن است در دو مسیر مختلف و مجزا از غشاء خارجی عبور کنند: انتشار از طریق پورین ها و منافذ خاص یا دو لایه فسفولیپیدی. سطح انتشار یک کینولون تا حد زیادی به خاصیت آبگریزی آن مرتبط و وابسته است. همه کینولون ها ممکن است از منافذ پورین غشاء عبور کنند، ولی آن هایی که سطوح آبگریزی بالاتری دارند آسان تر می توانند از دو لایه فسفولیپیدی عبور کنند. بنابراین تغییرات در ترکیب پورین ها و یا لیپوپلی ساکاریدها ممکن است پروفایل های حساسیت را تغییر دهد. در موتانت های لیپوپلی ساکاریدی ناقص، افزایش حساسیت به کینولون های آب گریز، بدون تغییر در سطح مقاومت به کینولون های آب دوست مشاهده شده است. تغییر در نفوذپذیری غشاء معمولاً به کاهش بیان پورین ها بستگی دارد. این موضوع در اشریشیا کلی و دیگر باکتری های گرم منفی گزارش شده است. افزایش بیان غیر اختصاصی، سیستم های افلوکس وابسته به انرژی باعث جلوگیری از تجمع غلظت های موثر کینولون ها در داخل سلول باکتری بوسیله پمپاژ فعالانه دارو به خارج از سلول می گردد. در اشریشیا کلی افلوکس پمپ AcrAB-TolC، نقش اصلی در افلوکسکینولون ایفا می کند. این سیستم های افلوکس باعث مقاومت سطح پایین نسبت به کینولون ها می شوند و هنگامی که با موتاسیون هایی در آنزیم های هدف و یا تغییرات در غشاء خارجی ترکیب شوند، می توانند به تبادلات بالینی ارتباط داشته باشند.

1-2-8-5-5 تغییرات در غشاء خارجی

باکتری های گرم منفی، بوسیله تغییر بیان پروتئین های پورین غشاء خارجی(omp) که به صورت کانال هایی برای انتشار غیر فعال تشکیل شده اند، می تواند نفوذناپذیری غشاء را تنظیم کنند. از دست دادن یا کاهش سطوح OmpF در مقاومت ضد میکروبی می تواند دخیل می باشد.

1-2-9 عوارض فلوروکینولون ها

بیشترین عوارض فلوروکینولون ها عوارض معده ای و روده ای می باشد، که این عوارض معمولا در 4 درصد از بیماران دیده شده است. مصرف تروافلوکسازین ها باعث ایجاد علائمی در سیستم اعصاب مرکزی می شود، در حالی که با مصرف اسپاروفلوکسازین حساسیت نوری دیده می شود. افزایش فاصله زمانی طول موج QT نشانه اصلی عوارض قلبی در کینولون ها است، اما این عوارض به طور اختصاصی در مصرف گریپافلوکسازین مشاهده می شود، که موجب جمع آوری آن از بازار شده است; 2003)et al (Gendrel. تروفلوکسازین به دلیل گزارش هایی در مورد سمیت کبدی و همچنین از کار افتادن کبد و مرگ ناشی از آن در حین درمان، در سال 1999 جمع آوری شده است. مصرف کینولون ها در کودکان باعث ایجاد عوارضی مثل آرتروپاتی و ضایعات پاتولوژیکی مثل: دمل های پر مایع و سوختگی شده است. این ضایعات همراه یا بدون انتشار مفصلی دیده شده است. فرض بر این است که تاثیر کینولون ها در برخی از حیوانات باعث ممانعت از رونویسی DNA میتوکندریایی می شود. فرضیه حیرت انگیز دیگر در ارتباط با بلاکه شدن یون منیزیم توسط فلوروکینولون ها است که احتمالا در بقاء ماتریکس غضروفی نقش دارند. متأسفانه، تنها دارویی که بیشترین اثر آرتروپاتی را در حیوانات ایجاد می کنند، نالیدیکسیک اسید است، که تنها داروی مورد تائید در کودکان می باشد و اثبات شده است این دارو به خوبی در این جمعیت قابل تحمل است. کینولون ها در کودکان بر روی غضروف ها اثر کرده که موجب درد در مفاصل می شوند(معمولا در افراد مبتلا به سیستیک فیبروزیس ).

1-3 اهداف تحقیق

1-3-1 هدف کلی تحقیق

بررسی مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید و مطالعه مولکولی آن در سویه های شیگلا جدا شده از موارد بالینی در تهران

1-3-2 اهداف جزئی تحقیق

- بررسی الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به آنتی بیوتیک های رایج در سویه های شیگلا ی تحت بررسی

- غربالگری اولیه مقاومت به فلوروکینولون ها با استفاده از روش های استاندارد تعین مقاومت میکروبی

- بررسی مولکولی مقاومت در سویه های مقاوم به این آنتی بیوتیک

1-3-3 هدف کاربردی

دست یابی به روش تشخیصی مناسب جهت شناسایی مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید در سویه های شیگل

1-3-4 فرضیات

-مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به نالیدیکسیک اسید در جنس شیگلا وجود دارد.

- شیوع سویه های مقاوم به فلوروکینولون ها در سویه های جدا شده از موارد بالینی تهران بالا است.

- مقاومت نسبت به فلوروکینولون ها اعم از نالیدیکسیک مربوط به وجود موتاسیون های ژنی gyrو qnr می باشد.

3-6 تعاریف واژه ها

- باکتری شیگلا: یکی از اعضای خانواده بزرگ باکتریهای روده ای یعنی انتروباکتریاسه که عامل اسهال خونی می باشد

- فلوروکینولون ها: این آنتی بیوتیک ها جزو مهار کننده های سنتز اسید نوکلئیک به شمار می روند و با مهار آنزیم های DNA جیراز و توپوایزومرازIV، سنتز DNA را متوقف می سازند.

- ژن gyrA: این ژن زیر واحد A آنزیم جیراز را کد می کند. این آنزیم درسیتوپلاسم سلول های باکتریایی قرار داردویک پروتئین تترامر متشکل ازدوزیرواحد A و دو زیر واحد B می باشد که به ترتیب توسط ژن های gyrA و gyrB کد می گردد.

- ژن qnr: این ژن یک پروتئین 218 اسیدآمینه ای با واحد های تکراری پنتا پپتیدی به نام Qnr را کد می کند که مسئول محافظت آنزیم DNA جیراز در برابر اثرات مهاری داروهای کینولونی می باشد.

- تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز): این تکنیک مجموعه ای از واکنش های بیوشیمیایی است که درطی آن قطعهمشخصی ازDNA به طور تصاعدی تکثیر می یابد، بدین ترتیب مقادیر انبوهی از DNA هدف ایجادمی گردد.

- تکنیک RFLP: در این روش لوکوس ژنتیکی ویژه ای که از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز با پرایمر های ویژه تکثیر یافته است، به کمک آنزیم های برش دهنده محدود الاثر مورد بررسی قرار می گیرد.

دریافت فایل

بررسی مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید و مطالعه مولکولی آن در سویه های شیگلا جدا شده از موارد بالینی در تهران

یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:10

0 نظر

فیلسوفان سیاسی قرن بیستم

با آنکه انسان واقعاً هزاران سال با مسائل سیاست دست به گریبان بوده‌ است، ما نمی‌توانیم فلسفهٔ سیاسی قرن بیستم را بفهمیم مگر آنکه خود قرن بیستم را بفهمیم ـ یعنی آن تکامل بسیار خاصی راکه در قرن ما در زندگی و جامعه بشری رخ داده است. نیازی به گفتن ندارد که چنین موضوعی گسترده ‌تر از آن است که بتوان اینجا و در این مجال به‌طور کامل بدان پرداخت. اما آنچه ما بدان نیاز داریم تعریف و توضیحی دائرهٔ‌المعارفی و جامع و مانع نیست. بلکه تشخیص روندهای اصلی و اساسی است. این روندها چه‌ها بوده‌اند؟ کجا باید چنین تشخیصی را جست؟

دریافت فایل

فیلسوفان سیاسی قرن بیستم

یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:10

0 نظر

بررسی کارایی و مکانیسم تأثیر اوجنول در تعدیل فعالیت خودبخودی و فعالیت صرعی القاء شده توسط پنتیلین تترازول در نورونهای حلزون

چکیده

اوجنول یک فنیل پروپن گیاهی و ترکیب اصلی عصاره میخک است که به واسطه خواص ضددرد و ضدعفونی کنندهاش شناخته شده میباشد. اوجنول کانالهای یونی متعدد از جمله کانالهای کلسیمی HVA، رسپتور NMDA، رسپتور گاباA، کانالهای سدیمی حساس و مقاوم به تترودوتوکسین و کانالهای پتاسیمی را تنظیممیکند. برهمکنش اوجنول با کانالهای یونی متعدد آن را یک تنظیمگر بالقوه تحریکپذیری نورونی ساخته است.در مطالعه حاضر با استفاده از تکنیک ثبت داخل سلولی اثرات اوجنول بر تحریکپذیری و الگوی فعالیت و نیز برهمکنش آن با فعالیت صرعی القاء شده با پنتیلنتترازول، در نورونهای گانگلیون زیر مری حلزون باغی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بررسی حاضر نشان داد که اوجنول یک اثر وابسته به غلظت بر فعالیت الکتریکی نورونها دارد. بکارگیری خارج سلولی غلظتهای پایین اوجنول (5/0 و 5/1 میلیمولار) دامنه، شیب فاز بالارو و فرکانس پتانسیلهای عمل را نسبت به شرایط کنترل کاهش داد، که این موارد پیشنهاد کننده مهار کانالهای سدیمی به وسیله اوجنول میباشد. بعلاوه اوجنول (5/1 میلیمولار) فعالیت انفجاری القاء شده با پنتیلنتترازول را سرکوب و فعالیت منظم با اسپایکهای منفرد را برقرار کرد. از طرف دیگر بکارگیری خارج سلولی اوجنول با غلظتهای بالا (5/2 میلیمولار) دامنه و مدت زمان AHP و شیب فاز پایین روی پتانسیلهای عمل را کاهش و فرکانس پتانسیلهای عمل را افزایش داد. در نهایت نیز الگوی فعالیت را از فرم منظم به فعالیت انفجاری تغییر داد. که بیانگر مهار احتمالی جریانهای رو به خارج پتاسیم و تقویت جریانهای رو به داخل کلسیم میباشد. فعالیت صرعی القاء شده با اوجنول با بکارگیری خارج سلولی نیفدیپین (بلوکر کانالهای نوع L) و نیکل کلرید (مهارکننده غیراختصاصی کانالهای کلسیمی) به طور کامل از بین رفت که این مورد حمایت کننده این است که تقویت جریان کلسیمی به وسیله اوجنول برای بروز فعالیت انفجاری الزامی میباشد. چنین به نظر میرسد که اوجنول در غلظتهای پایینتر میتواند به طور مؤثری جریان سدیمی را سرکوب کرده و تحریکپذیری نورونی را کاهش دهد در صورتیکه در غلظتهای بالاتر اثر آن در جهت مهار جریانهای پتاسیمی غالب شده و منجر به بروز فعالیت انفجاری میشود.

کلمات کلیدی: اوجنول، نورون حلزون، فعالیت ضدصرعی، فعالیت انفجاری، کانالهای یونی

فهرست مطالب

فصل اول

1- مقدمه.. 2

دلایل استفاده از نورونهای حلزون.. 6

فصل دوم

2- مروری بر تحقیقات پیشین.. 9

2-1- صرع.. 9

2-2- اسانس های گیاهی.. 10

الف ) ترپنها:.. 11

ب) ترکیبات آروماتیک.. 11

2-3- اثرات بیولوژیک اسانسهای گیاهی.. 12

2-3-1- اثرات موتاژنیک اسانسها در سطح هسته و سیتوپلاسم 12

2-3-2- اثرات آنتی موتانژنیک اسانسها.. 13

2-3-3- اثرات سیتوتوکسیک اسانسهای گیاهی.. 13

2-3-4- خواص سرطان زایی اسانسهای گیاهی.. 14

2-4- ترکیبات اسانس‌ها و عملکرد آن‌ها روی سیستم عصبی مرکزی و محیطی 14

2-4-1- لینالول.. 15

2-4-2- اکالیپتول.. 15

2-4-3- سیترونلول.. 16

2-4-4- منتول.. 16

2-4-5- اوجنول.. 17

2-5- کانالهای یونی و مشارکت آنها در فعالیت الکتریکی نورونها 20

2-5-1- کانالهای پتاسیمی.. 20

2-5-1-1- کانالهای پتاسیمی وابسته به ولتاژ.. 21

2-5-1-2- کانالهای پتاسیمی وابسته به کلسیم.. 21

2-5-2- کانالهای کلسیمی.. 23

2-5-3- کانال های سدیمی.. 24

جریان‌های سدیمی گذرا و مداوم.. 25

2-6- هدف.. 26

فصل سوم

3- مواد و روش‌ها.. 28

3-1- حیوانات.. 28

3-2- تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت.. 29

3-3- محلول‌ ها و داروها.. 30

3-4- ثبت داخل سلولی.. 30

3-5- مراحل آزمایش.. 32

3-6- پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه.. 33

3-7- آزمون آماری.. 34

فصل چهارم

4- نتایج.. 36

4-1- ویژگی‌های فعالیت خودبخودی و برانگیخته نورون‌های حلزون در شرایط کنترل.. 36

4-2- ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی و ویژگیهای غیر فعال غشاء در حضور غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار اوجنول.. 37

4-3- بررسی اثر اوجنول بر فعالیت صرعی القاء شده با پنتیلن تترازول (PTZ).. 49

4-3-1- پتانسیل استراحت غشاء و ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی در حضور پنتیلنتترازول و اوجنول.. 49

4-3-2 پتانسیل استراحت غشاء و ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی در حضور اوجنول و پنتیلنتترازول.. 56

4-4- بررسی نقش احتمالی کانالهای سدیمی در اثرات القاء شده با اوجنول.. 60

4-4-1- پتانسیل استراحت غشاء و ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوجنول وریلوزول.. 60

4-4-2- پتانسیل استراحت غشاء و ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور ریلوزول و اوجنول.. 65

4-4-3- پتانسیل استراحت غشاء، الگوی فعالیت و ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور PTZ، ریلوزول و اوجنول.. 70

4-5- پتانسیل استراحت غشاء، الگوی فعالیت و ویژگیهای پتانسیل عمل خودبهخودی در حضور غلظتهای 2 و 5/2 میلی مولار اوجنول 74

4-6- فعالیت و ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور اوجنول 5/2 میلیمولار و نیکل کلرید و نیفدیپین.. 82

فصل پنجم

5- بحث و نتیجه‌گیری.. 87

5-1- تغییر ویژگی‌های پتانسیل عمل و الگوی فعالیت نورون در حضور غلظتهای مختلفاوجنول.. 87

5 -2- ویژگیهای پتانسیل عمل در حضور همزمان اوجنول و ریلوزول 92

5-3- مهار فعالیت صرعی القاء شده با پنتیلن تترازول (PTZ) توسط اوجنول.. 94

5-4- اثرات ریلوزول و اوجنول بر فعالیت صرعی القاء شده با PTZ 97

5-5- نتیجهگیری.. 99

5-6- پیشنهادات برای مطالعات آینده.. 99

منابع و ماخذ.. 100

منابع فارسی.. 100

منابع لاتین.. 100

فهرست شکلها

شکل 3-1- حلزون باغی.. 28

شکل 3-2- گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت.. 29

شکل 3-3- نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی.. 31

شکل 3-4- نحوه اندازه گیری برخی پارامترهای پتانسیل عمل 34

شکل 4-1- الگوی فعالیت خودبخودی در شرایط کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از مجاورت با غلظتهای 5/0 میلیمولار (A) و 5/1 میلیمولار (B) اوجنول 38

شکل 4-2- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 5 دقیقه (b) و 10 دقیقه (c) پس از افزودن اوجنول 5/0 (A) و 5/1 (B) میلیمولار... 40

شکل 4-3- مقایسه ویژگیهای AHP در پتانسیلهای ثبت شده از یک نورون بین دو حالت کنترل (a) و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 5/1 میلیمولار (b).. 44

شکل 4-4- فرکانس فعالیت در طی تزریق جریان دپلاریزه کننده (nA2) 46

شکل 4-5- الگوی فعالیت خودبهخودی نورون در شرایط کنترل (A)، 3 دقیقه پس از بکارگیری PTZ (mM15) (B)، 2، 5 و 10 دقیقه پس از بکارگیری اوجنول 5/1 میلیمولار (D, E. F).. 50

شکل 4-6- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM 15) (b) و 10 دقیقه پس از اوجنول (mM 5/1) (c). به دنبال بکارگیری PTZ دامنه پتانسیل عمل و شیب فاز رپلاریزاسیون کاهش و مدت زمان پتانسیل عمل افزایش یافت. اوجنول منجر به تشدید این اثرات شد بعلاوه شیب فاز دپلاریزاسیون را نیز کاهش داد. 52

شکل 4-7- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM 15) (b) و 10 دقیقه پس از اوجنول (mM 5/1) (c).. 55

شکل 4-8- الگوی فعالیت خودبهخودی نورون در شرایط کنترل، 5 دقیقه پس از اوجنول (5/1 میلیمولار)، 10 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM15). مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 5 دقیقه پس از افزودن.. 58

شکل 4-9- الگوی فعالیت خودبخودی نورون در شرایط کنترل، 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول (1 میلیمولار)، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول (150 میکرومولار).. 61

شکل 4-10- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلی مولار (b) و 10 دقیقه پس از بکارگیری ریلوزول 150 میکرو مولار (c)... 63

شکل 4-11- الگوی فعالیت خودبهخودی نورون در شرایط کنترل، 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول (150 میکرومولار)، 5 و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول (1 میلیمولار).. 67

شکل 4-12- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در سه زمان کنترل (a)، 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول 150 میکرومولار (b) و 10 دقیقه پس از مجاورت با اوجنول 1 میلیمولار (c)... 69

شکل 4-13- الگوی فعالیت خودبخودی در شرایط کنترل، 7 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM 15)، 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول (150 میکرو مولار)، 5 و 10 دقیقه پس از بکارگیری اوجنول (1 میلیمولار) 73

شکل 4-14- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در چهار زمان کنترل، 10 دقیقه پس از کاربرد PTZ (mM 15)، 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از مجاورت با اوجنول 1میلیمولار 74

شکل4-15- الگوی فعالیت خودبخودی در شرایط کنترل، و پس از مجاورت با غلظتهای 2 (A) و 5/2 (B) میلیمولار اوجنول و 10 دقیقه پس از شستشوی محفظه حاوی اوجنول با رینگر حلزونی نرمال.. 75

شکل 4-16- مقایسه پتانسیل ثبت شده از یک نورون در دو زمان کنترل (a) و 5 دقیقه (b) پس از افزودن اوجنول 2 (A) و 5/2 (B) میلیمولار 77

شکل 4-17- مقایسه مدت زمان sAHP متعاقب تزریق جریان دپلاریزه کنندهnA 2 بین حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن اوجنول 2 میلیمولار 81

شکل 4-18- پس از بروز فعالیت انفجاری در نتیجه افزودن اوجنول 5/2 میلیمولار، (mM4) NiCl به محفظه ثبت اضافه گردید... 83

شکل 4-19- پس از بروز فعالیت انفجاری در نتیجه افزودن اوجنول 5/2 میلیمولار، نیفدیپین (Nif.) به محفظه ثبت اضافه گردید. 84

شکل 4-20- پس از بروز فعالیت فعالیت انفجاری در نتیجه افزودن اوجنول 5/2 میلیمولار، ابتدا نیفدیپین (Nif.) 40 میکرومولار و بعد از 12 دقیقه NiCl (4 میکرومولار) به محفظه ثبت اضافه گردید.. 85

فهرست نمودارها

نمودار 4-1- نمودار مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A) و فرکانس پتانسیل عمل (B) در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار اوجنول به رینگر حلزونی نرمال (9₌n). 05/0 P<^*و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 37

نمودار 4-2- مقایسه آستانه در پتانسیلهای عمل ثبت شده در حضور غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار (9n₌). 05/0 P<^*و 01/0 P<^**در مقایسه با کنترل. 39

نمودار 4-3- مقایسه دامنه (A) و overshoot پتانسیل عمل (B) در پتانسیلهای عمل ثبت شده در حضور غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار (9n₌). 05/0 P<^*و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^## در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 41

نمودار 4-4- میانگین طول مدت پتانسیل عملهای ثبت شده در حضور غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار (9n₌). 05/0 P<^*و01/0 P<^** در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# و01/0 P<^##در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول. 42

نمودار 4-5- شیب فاز دپلاریزاسیون (A)، بیشینه شیب فاز دپلاریزاسیون (B) و شیب فاز رپلاریزاسیون (C) پتانسیلهای عمل ثبت شده در حضور غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار (9n₌). 01/0 P<^**و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^##و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 43

نمودار4-6- مقایسه مدت زمان (A) و دامنه (B) AHP پتانسیل عمل بین سه حالت کنترل، 5 دقیقه و 10 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار اوجنول (9₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001 /0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 45

نمودار 4-7- مقایسه فرکانس (A) و overshoot (B) پتانسیل های عمل در حین تزریق جریان‌دپلاریزه کننده (nA2) در شرایط کنترل و در 5 و 10 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار اوجنول به رینگر حلزونی نرمال (9₌n). 05/0 P<^*و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 47

نمودار 4-8- مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A) و فرکانس شلیک پتانسیل عمل (B) بین سه حالت کنترل، 5 دقیقه پس از افزورن PTZ (mM15) و 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول (mM 5/1) (9₌n). 01/0 P<^** و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد PTZ... 51

نمودار 4-9- مقایسه مدت زمان پتانسیل عمل (A) و دامنه پتانسیل عمل (B)در شرایط کنترل، 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM15) و 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول 5/1 میلیمولار در رینگر حلزونی نرمال (9₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^## در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد PTZ... 52

نمودار 4-10- مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون (A) و شیب فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل (B) در شرایط کنترل، 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM15) و 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول 5/1 میلیمولار در رینگر حلزونی نرمال (9₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد PTZ. 53

نمودار 4-11- مقایسهی مدت زمان (A) و دامنه (B) AHP متعاقب پتانسیل عمل منفرد بین سه حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM15) و 10 دقیقه بعد از بکارگیری اوجنول 5/1 میلیمولار (9₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^** و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل و 001/0 P<^###در مقایسه با 5 دقیقه پس از بکارگیری PTZ... 54

نمودار 4-12- مقایسه مدت زمان sAHP متعاقب تزریق جریان دپلاریزه کننده nA2 بین سه حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن PTZ (mM15) و 10 دقیقه پس از اوجنول (mM5/1) (9₌n). 01/0 P<^** در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^## در مقایسه با 5 دقیقه پس از PTZ... 55

نمودار 4-13- مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A)، آستانه پتانسیل عمل (B) فرکانس شلیک (C) و دامنه پتانسیل عمل (D) بین سه حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن اوجنول 5/1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد PTZ (mM15) (6₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^** و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل... 57

نمودار 4-14- مقایسه میانگین طول مدت پتانسیل عمل (A)، شیب فاز دپلاریزاسیون (B)، شیب فاز رپلاریزاسیون پتانسل عمل (C)، طول مدت AHP (D) و دامنه AHP (E) بین سه حالت کنترل، 5 دقیقه پس از افزودن اوجنول 5/1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد PTZ (mM15) (6₌n). 05/0 P<^* و 01/0 P<^**در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# در مقایسه با 5 دقیقه پس از اوجنول... 59

نمودار 4-15- مقایسه میانگین آستانه پتانسیل عمل (A) و فرکانس شلیک پتانسیل عمل (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار (5₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل... 62

نمودار 4-16- مقایسه میانگین دامنه پتانسیل عمل (A) و مدت زمان پتانسیل عمل (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار (5₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# و 01/0 P<^## در مقایسه با 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 62

نمودار 4-17- مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون (A) و شیب فاز رپلاریزاسیون (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار (5₌n). 01/0 P<^**و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^## در مقایسه با 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 64

نمودار 4-18- مقایسه میانگین طول مدت زمان AHP (A) و دامنه AHP (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار و 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار (5₌n). 05/0 P<^*در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# در مقایسه با 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول. 64

نمودار 4-19- مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A) و آستانه پتانسیل عمل (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (6₌n). 05/0 P<^*در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^# در مقایسه با 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول... 65

نمودار 4-20- مقایسه میانگین فرکانس شلیک پتانسیل عمل (A) و دامنه پتانسیل عمل (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از کاربردریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (6₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و001/0 P<^***در مقایسه با کنترل و 01/0 P<^## در مقایسه با 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول... 66

نمودار 4-21- مقایسه میانگین طول مدت پتانسیل عمل (A)، شیب فاز دپلاریزاسیون (B) و شیب فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل (C) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (6₌n). 05/0 P<^* و 01/0 P<^**در مقایسه با کنترل... 68

نمودار 4-22- مقایسه میانگین طول مدت AHP (A) و دامنه AHP (B) بین سه حالت کنترل، 10 دقیقه پس از کاربرد ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (6₌n). 01/0 P<^**و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل... 70

نمودار 4-23- مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A) و آستانه پتانسیل عمل (B) بین چهار حالت کنترل، 5 دقیقه پس از کاربرد PTZ (mM 15)، 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (5₌n)... 71

نمودار 4-24- مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A)، آستانه (B) و فرکانس پتانسیل عمل (C) در شرایط کنترل و در 5 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 2 و 5/2 میلیمولار اوجنول به رینگر حلزونی نرمال (7₌n). 05/0 P<^*و 01/0 P<^**در مقایسه با کنترل... 76

نمودار 4-25- مقایسه دامنه (A) و مدت زمان پتانسیل عمل (B) در پتانسیلهای عمل ثبت شده در حضور غلظتهای 2 و 5/2 میلیمولار (7n₌). 01/0 P<^** و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل... 78

نمودار 4-26- مقایسه میانگین شیب فاز دپلاریزاسیون (A) و رپلاریزاسیون (B) پتانسیل عمل در شرایط کنترل و در 5 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 2 و 5/2 میلیمولار اوجنول به رینگر حلزونی نرمال (7=n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل... 79

نمودار 4-27- مقایسه مدت زمان (A) و دامنه (B) AHP متعاقب پتانسیل عمل منفرد بین دو حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 2 و 5/2 میلیمولار اوجنول (7₌n). 05/0 P<^*و 001/0 P<^***در مقایسه با کنترل. 80

نمودار 4-28- مقایسه مدت زمان sAHP متعاقب تزریق جریان دپلاریزه کننده nA2 بین دو حالت کنترل و 5 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 2 و 5/2 میلیمولار اوجنول (7₌n). 05/0 P<^*و 01/0 P<^** در مقایسه با کنترل.81

فهرست جدولها

جدول 4-1- مقایسه میانگین (Interspike interval) ISI ، (Depolarization time) Dt، (Repolarization time) Rt و (input resistance) R_inبین سه حالت کنترل، 5 دقیقه و 10 دقیقه پس از افزودن غلظتهای 5/0 و 5/1 میلیمولار اوجنول (9₌n). 05/0 P<^*، 01/0 P<^**و 001/0 P<^*** در مقایسه با کنترل و 05/0 P<^#در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد اوجنول... 48

جدول 4-2- مقایسه میانگین فرکانس شلیک پتانسیل عمل، دامنه و طول مدت پتانسیل عمل، شیب فاز دپلاریزاسیون (Dep. Slope)، شیب فاز رپلاریزاسیون (Rep. slope)، طول مدت AHP و دامنه آن (AHP, ampl.) و مدت AHP آهسته متعاقب فعالیت برانگیخته حاصل از تزریق جریان‌ دپلاریزه کننده nA2 (sAHP, duration) بین چهار حالت کنترل، 5 دقیقه پس ار کاربرد PTZ (mM 15)، 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول 150 میکرومولار و 10 دقیقه پس از افزودن اوجنول 1 میلیمولار (5₌n). 05/0 P<^* و 01/0 P<^**در مقایسه با کنترل، 05/0 P<^# و 01/0 P<^## و 001/0 P<^### در مقایسه با 5 دقیقه پس از کاربرد PTZ، 05/0 P<^┼ و 01/0 P<^┼┼ در مقایسه با 10 دقیقه پس از افزودن ریلوزول... 72

جدول 4-3- مقاومت ورودی سلول در شرایط کنترل، 5 و 10 دقیقه پس از کاربرد اوجنول 2 و 5/2 میلیمولار... 82

فصل اول

1- مقدمه

صرع یک اختلال پیچیده عصبی میباشد که 1 تا 2 درصد از کل جمعیت جهان را مورد تأثیر قرار داده است. عفونتهای سیستم عصبی مرکزی، شوک عاطفی، اختلالات متابولیک، الکل، تومورهای مغزی و مشکلات عروقی مغز از مهمترین عوامل زمینهساز صرع هستند. صرع معمولاٌ قابل کنترل اما غیرقابل درمان است(Cascino, 1994) . تشنج مشخصه اصلی صرع بوده و بیانگر فعالیت نورونی غیرطبیعی و بیش از حد مغز میباشد که با یک الگوی خودبخودی، تکرار شونده و غیرقابل پیشبینی بروز میکند (Stafstrom, 2003).

شواهدی مبنی بر دخالت تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف به ویژه گلوتامات، آسپارتات و گابا در ایجاد صرع وجود دارد (Pinto, et al., 2005). به طور کلی تغییر در الگوی فعالیت سیناپسها و مختل شدن عملکرد کانالهای یونی، به عنوان مکانیسمهای اصلی زمینهساز حملههای صرعی شناخته شدهاند (Nobels, 2003; Wuttke and Lerche, 2006). متداولترین روش پیشگیری و درمان صرع استفاده از داروهای سنتزی ضدصرع است که با تأثیر بر زیرساختارهای سلولی دخیل در عملکرد سیناپسها و کانالهای یونی از بروز الگوی فعالیت صرعی در کانون صرع جلوگیری کرده یا گسترش آن به سایر نواحی و بروز تشنج را مهار میکند(Bialar and White, 2010) .

تاریخچه استفاده از گیاهان دارویی با اهداف درمانی مقارن است با تاریخ زندگی بشر. در پزشکی سنتی استفاده از عصاره خام گیاهان، به صورت خوراکی یا موضعی، نقش مهمی در درمان بسیاری از بیماریها، خصوصاٌ کنترل عفونتها داشته است (Navarro, et al., 1996). در دهههای اخیر آشکار شدن عوارض جانبی داروهای شیمیایی منجر به توجه مجدد به روشهای درمانی طبیعی و به راه افتادن موج جدیدی از پژوهشها در زمینه گیاهان دارویی شده است ((Braun and Cohen, 2007.

امروزه علاوه بر استفادههای بالینی، محصولات طبیعی مذکور به منظور کشف اهداف جدیدی از جمله رسپتورها و کانالها، حائز اهمیتاند ((Vriens, et al., 2008.

اسانسهای گیاهی[1] ترکیبات مایع، فرار، محلول در چربی، اغلب زلال و به ندرت رنگی میباشند که در بخشهای مختلف گیاه از جمله جوانه، برگ، گل، ساقه، دانه و میوه تولید و ذخیره میشوند (Bakkali, et al., 2008). اسانس‌ها به طور معمول از ترپنهای[2] آروماتیک فرار و فنیل پروپانوئیدها تشکیل شده‌اند که به واسطه عبور آزادانهشان از غشاء سلول میتوانند نقشهای سیگنالینگ متنوعی در سلول داشته باشند. در این ارتباط گزارشهایی حاکی از مداخله اسانس‌های گیاهی با کانال‌های یونی و رسپتورها نیز وجود دارد (Goncalves, et al., 2008).

ترپنهای گیاهی به عنوان دارو، چاشنی و طعم دهنده مواد غذایی و خوشبوکننده مورد استفاده قرار می‌گیرند. مونوترپنها ترکیباتی با فرمول مولکولی C₁₀H₁₆ میباشند که هم در فراوردههای گیاهی با اثر صرعزا[3] و هم در فراوردههایی با اثرات ضدصرع[4] یافت می‌شوند (Burkhard, et al., 1999; Ishida, 2005). انواعی از عصارههای گیاهی و اسانسهای روغنی استخراج شده از گیاهان جهت درمان صرع مورد استفاده قرار می‌گیرند. تحقیقات روی این گیاهان نشان داده که عصاره آنها حاوی ترکیباتی با خواص ضدتشنجی هستند و قادر به مهار فعالیت صرعی القاء شده توسط پنتیلنتترازول[5]((PTZ میباشند (Sayyah, et al., 2002).

PTZ آنتاگونیست گابا است که با مهار رسپتور گاباA باعث کاهش عملکرد گاباارژیک میشود (Olsen, 1981). بنابرین داروهایی که عمل سیستم گابا را از طریق رسپتور گاباA تقویت میکنند میتوانند در جلوگیری از صرع القاء شده توسط PTZمؤثر باشند (Snead, 1992). از جمله مونوترپنهایی که اثرات ضدصرعی به آنها نسبت داده شد میتوان به اوجنول[6]، لینالول[7]، منتول[8] و لیمونن[9] اشاره کرد (Burkhard, et al., 1999).

اوجنول یک فنیلپروپن است که از گیاهان متعددی از جمله درخت جوز[10]، میخک[11]، دارچین[12]و ریحان[13] استخراج میشود، با اکسید روی ترکیب شده و صمغی را ایجاد میکند که به خاطر ویژگیهای ضدباکتریایی، ضدالتهاب، بیحسکنندگی موضعی و ضددردش به طور گستردهای در دندانپزشکی به کار میرود (Hashimoto, et al., 1988; Ohkubo, et al., 1997; Kim, et al., 2003; Pizzo, et al., 2006; Chaieb, et al.,2007; Zheljazkov, et al., 2008). این ترکیب به عنوان چاشنی و طعم دهنده در محصولات غذایی و همچنین ماده خوشبوکننده در محصولات آرایشی مورد استفاده قرار میگیرد (Opdyke, 1975).

از آنجا که اوجنول در گیاهان و ادویهجات پرمصرف به وفور یافت میشود، بررسی خواص و برهمکنشهای آن با اجزای مختلف سلولی به نظر ضروری میرسد. نشان داده شده که اوجنول با طیف وسیعی از کانالها و رسپتورهای غشائی برهمکنش داده و اثرات بیولوژیک متنوعی از خود به جای میگذارد. اوجنول در سیستم عصبی اثرات متعددی را اعمال میکند، از جمله: حفاظت از سلولهای عصبی در برابر ایسکمی و پپتید بتاآمیلویید (Irie and Keung, 2003; Wie, et al., 1997; Won et al., 1998)، مهار هدایت پتانسیلهای عمل در عصب سیاتیک (Kozam, 1997)، بهبود بخشیدن عوارض عصبی و نورونی ناشی از دیابت (Nangle et al., 2006) و سرکوب پتانسیلهای میدانی صرعی که نشاندهنده یک پتانسیل درمانی برای اوجنول در صرع میباشد (Muller et al., 2006). مشخص شده اوجنول یک اثر ضدصرعی وابسته به زمان و غلظت مورد استفاده دارد (Sayyah et al., 2004). این ترکیب رسپتورهای N-متیل-D-آسپارتات(NMDA) را مهار و رسپتورهای ایونوتروپیک گابا را تقویت میکند که هر دو رسپتور مذکور در احساس درد دخیلاند (Aoshima and Hamamoto, 1999; Wie et al.,1997). این مولکول همچنین پتانسیل عملهای مرکب را در فیبرهای A و C تضعیف میکند. موارد مذکور میتوانند توضیحی بر اثر ضددرد اوجنول باشند (Brodin, 1985). علاوه بر موارد فوق، خواص آنتیاکسیدانی (Li et al., 2006) و ضدسرطانی (Pal, et al., 2010) آن نیز گزارش شده است.

با توجه به مطالعات انجام شده، تصور بر این است که کانال‌های یونی اهداف فارماکولوژیک مهم ترکیبات طبیعی می‌باشند. انواع کانال‌های یونی سدیمی، کلسیمی و پتاسیمی در غشاء سلول‌های تحریک‌پذیر از جمله نورون‌ها وجود دارند و از آنجا که در سیستم عصبی، انتقال پیام وابسته به پتانسیل عملهایی است که از فعالیت هماهنگ کانالهای یونی متنوع حاصل میشوند، هر ترکیبی که قادر به اثر گذاشتن بر ویژگی‌های پتانسیل عمل و بعبارتی کانال‌های یونی باشد در تحریک‌پذیری سلول نیز مؤثر خواهد بود (Catteral, 2010). کانال‌های یونی در فرایندهای فیزیولوژیکی مختلف از جمله رهایش نوروترنسمیتر، جفت شدن تحریک-انقباض[14]، کنترل بیان ژن و تکوین سلولی نقش دارند. از طرفی اختلال عملکرد کانال‌های یونی می‌تواند منجر به اختلالات پاتولوژیک شود. به منظور تأیید تأثیر ترکیبات طبیعی بر کانال‌های یونی، استفاده از آنتاگونیست‌ها و آگونیست‌ها‌ی بسیار انتخابی لازم است (Bulaj, 2008). گزارشهایی حاکی از مداخله ترکیبات اسانس‌های گیاهی با فعالیت کانال‌های یونی و رسپتورها وجود دارد که تکنیک‌های الکتروفیزیولوژیک برای تشخیص و شناسایی اثرات بیولوژیکی ترکیبات و چگونگی برهمکنش آن‌ها با کانال‌های یونی بسیار مؤثر هستند (Goncalves, et al., 2008).

دلایل استفاده از نورونهای حلزون

در تحقیقات انجام شده روی الگوی فعالیت صرعی و روشهای درمان آن از مدلهای حیوانی مختلف استفاده شده است. با این حال مکانیسمهای اساسی ایجاد کننده الگوی فعالیت صرعی در نمونههای جانوری مختلف مشابه است. از طرفی نتایج تحقیقات مختلف نشان داده است که الگوی فعالیت صرعی ایجاد شده در نورونهای حلزون با الگوی فعالیت ثبت شده در سیستم عصبی مهرهداران از جمله انسان شباهت دارد (Janahmadi, et al., 2008).

مزایای تکنیکی متعدد نورونهای گانگلیون بیمهرگان در مقایسه با نورونهای مهرهداران از جمله وجود نورونهای بزرگ قابل تشخیص، تنوع کانالهای یونی و امکان مطالعه گانگلیون در شرایط in vitro بدون تغییر در ویژگیهای ساختمانی و عملکردی باعث شده تا این نورونها در موارد متعددی جهت مطالعه مکانیسمهای پایه سیستم عصبی مورد استفاده قرار گیرند. نرم‌تنان بزرگترین نورون‌ها را در سلسله جانوران دارند و اندازه بزرگ نورون‌هایشان، شناسایی و ورود الکترود به سلول را تسهیل می‌کند و از طرفی خونسرد بودن این رده جانوری، مشکلات نگهداری آن‌ها را در شرایط in vitro کاهش می‌دهد. این عوامل باعث شدند بسیاری از مطالعات اولیه الکتروفیزیولوژیک برای نخستین بار روی نورون‌های نرم‌تنان انجام شوند (Hodgkin and Hoxley, 1939; 1952). در مقایسه با نمونههای بیمهره، مطالعه مکانیسم‌های سلولی و مولکولی در نورون‌های پستانداران اغلب مستلزم مراحل آماده‌سازی است که ممکن است همراه با تغییراتی در سازمانبندی کلی نورون‌ها باشد. به علاوه اندازه بسیار کوچک نورون‌ها و نیاز به شرایطی با حداقل تغییرات نسبت به شرایط in vivo، انجام ثبت داخل سلولی را مشکل می‌سازد. عملکرد سیستم عصبی بی‌مهرگان و مهره‌داران از جهات بسیاری شبیه میباشد، از جمله داشتن گیرنده‌های حسی، شبکه عصبی مرکزی، خروجی‌های حرکتی و مجموعه‌ای از ناقل‌های عصبی، مسیرهای انتقال سیگنال و انواع کانال‌های یونی مشابه (Altrup, et al., 1992). بنا به دلایل ذکر شده بویژه امکان القاء فعالیت صرعی و حضور تنوعی از کانالهای یونی غشائی، استفاده از نورونهای حلزون روش مناسبی جهت مطالعه برهمکنشهای احتمالی اوجنول با کانالهای یونی و مکانیسمهای دخیل در فعالیت صرعی میباشد

[1]Essential oils

[2] Terpene

[3] Epileptogene

[4] Antileptic

[5] Pentylenetetrazole

[6]Eugenol

[7] Linalool

[8] Menthol

[9] Limonene

[10] Nutmeg

[11] Clove

[12] Cinnamon

[13] Basil

[14]Excitation-Contraction coupling

دریافت فایل

بررسی کارایی و مکانیسم تأثیر اوجنول در تعدیل فعالیت خودبخودی و فعالیت صرعی القاء شده توسط پنتیلین تترازول در نورونهای حلزون

یاهو مارکت پنج‌شنبه 16 آذر 1396 ساعت 23:10

0 نظر

بایگانی

جستجو

چکیده

فصل اول

کلـیات تحقیق

1- مقدمه

1-1 بیان مسئله

1-2 کلیات

1-2-1 باکتریولوژی شیگلا

1-2-2 طبقه بندی شیگلا

1-2-3 فاکتورهای ویرولانس شیگلا

1-2-4 توصیف علائم بیماری ناشی از عفونت با شیگلا

1-2-5 اپیدمیولوژی

1-2-6 تشخیص آزمایشگاهی

1-2-6-1 کشت

1-2-6-2 تست های بیوشیمیایی

1-2-6-3 روش های مولکولی(PCR )

1-2-7 کنترل و پیشگیری

1-2-7-1 بهداشت فردی

1-2-7-2 واکسن ها

1-2-8 درمان

1-2-8-1 مقاومت دارویی و اهمیت آن در شیگلا

1-2-8-2 تاریخچهاستفاده از کینولون ها و فلوروکینولون ها به عنوان آنتی بیوتیک

1-2-8-3 کاربرد فلوروکینولون ها در درمان عفونت های انسانی

1-2-8-4 مکانیسم عمل کینولون ها

1-2-8-4-1 آنزیم DNA جیراز

1-2-8-4-1-1 نقش آنزیم DNA جیراز سلول های باکتریایی

1-2-8-5 مقاومت به فلوروکینولون ها

1-2-8-5-1 موتاسیون در ژن های شیگلا

1-2-8-5-2 تغییرات در توپوایزومراز IV

1-2-8-5-3 مقاومت وابسته به پلاسمید

1-2-8-5-4 کاهش جذب و تغییرات در افلوکس پمپ ها

1-2-8-5-5 تغییرات در غشاء خارجی

1-2-9 عوارض فلوروکینولون ها

1-3 اهداف تحقیق

1-3-1 هدف کلی تحقیق

1-3-2 اهداف جزئی تحقیق

1-3-3 هدف کاربردی

1-3-4 فرضیات

3-6 تعاریف واژه ها