جزوه طراحی سازه های بتنی ویژه آزمون محاسبات ویرایش 96

جزوه طراحی سازه های بتنی ویژه آزمون محاسبات ویرایش 96 در این پست جزوه طراحی سازه های بتنی ویژه آزمون محاسبات تالیف مسعود حسین زاده اصل ویرایش پاییز 1396 با فرمت pdf (آماده پرینت) در 242 صفحه در اختیار شما عزیزان قرار گرفته است،در صورت نیاز می توانید این جزوه ارزشمند را با کمترین هزینه از فروشگاه خریداری و دانلود نمایید. امید است مفید واقع شود. دریافت فایل جزوه طراحی سازه های بتنی ویژه آزمون محاسبات ویرایش 96

دانلود کتاب زمین شناسی تاریخی پیام نور

دانلود کتاب زمین شناسی تاریخی پیام نور دانلود کتاب زمین شناسی تاریخی پیام نور فرمت پی دی اف زبان فارسی با کیفیت مناسب دریافت فایل دانلود کتاب زمین شناسی تاریخی پیام نور

غلظت های گوناگون NH4No3 و KNO3 بر روند کشت بافت گل اطلسی Petunia hybrida L.

غلظت های گوناگون NH4No3 و KNO3 بر روند کشت بافت گل اطلسی Petunia hybrida L. چکیده: گیاه اطلسی از تیره سیب زمینی (Solanaceae)است.اطلسی یک گیاه تزینی اقتصادی خوبی بشمار می رود. کشتبافتگیاهییکناماختصاریبرایکشتپروتوپلاستculture)(Protoplastوکشتبافت(Tissue culture) ،کشتسلول(Cell culture) میباشد.استفاده از فنون کشت بافت،روش انتخابی مناسبی برای اصلاح وارتقای خصوصیات کیفی این گل می باشد.برای این منظور در یک طرح کاملا تصادفی،پایه ای استریل گیاهان اطلسی در محیط پایه ی MS به گروه های شاهد وتیماری تقسیم کرده ایم.هدف از این پژوهش بررسی اثر غلظت های NH4NO3وKNO3 در محیط های کشت در شیشه بر تغییرات تکوینی گل اطلسی در شرایط مذکور است.در محیط ها غلظت هر یک از ترکیبات ,NH4NO3برابر با 0,10,13,20,40 میلی مول برابر حد تعیین شده در محیط کشت در نظر گرفته شده است. همچنین محیط ها غلظت هر یک از ترکیبات ,KNO3برابر با 0,9,12,18,36 میلی مول برابر حد تعیین شده در محیط کشت در نظر گرفته شده است آنالیز سنجش رنگیزه های فتوسنتزی ،سنجش کربوهیدرات ها،سنجش پرولین،سنجش فعالیت های آنزیمی شامل ( آنزیم پراکسیداز ها و آنزیم کاتالاز)،سنجش پروتین ها،آنالیز رشد انجام داده ایم.نیتیجه حاصل بررسی غلظت های گوناگون NH4No3 و KNO3 بر روند کشت بافت گیاه اطلسی موفق آمیز است,و اثرات افزاینده ای دارد.نتایج مطالعات ماکروسکوپی فاکتور های رشد و فعالیت فیزیولژیکی نشان داد که کمبود یا مسمومیت عناصر باعث کاهش در فاکتور های رشد و تغییر فعالیت فیزیولوژی می شود.در برخی از فاکتورهای رشد وزن تر و خشک گیاه،مساحت برگ،شاخص های LAR,GGR در سطخ %1 معنی دار بوده است.نتایج فیزیولوژی نشان داد که با افزایش نیترات آمونیوم گیاه وارد مرحله مسمومیت شد و این حالت کاهش میزان کلروفیل ، قند محلول ، پرولین وافزایش میزان قند نا محلول ، پروتئین ،آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز در گیاه می شود و با افزایش نیرات پتاسیم در گیاه شاهده افزایش میزان کلروفیل ، قند محلول ،پروتئن ، پرولین و همچنین کاهش قند نامحلول و آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز در گیاه می شود. نیترات آمونیوم،نیترات پتاسیم،اطلسی petunia hybrida ،کشت بافت فهرست مطالب عنوان صفحه چکید1 فصل اول:کلیات تحقیق مقدمه2 1-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی8 1-2 تعریف کشت بافت گیاهی15 1-3تکنیک های کشت بافت گیاهی17 1-4فواید کشت بافت گیاهان دست نخورده و کامل18 1-5 برخی از کاربرد های تکنیک های کشت بافت و سلول18 1-6موارد کاربرد کشت بافت گیاهی19 1-7-1 اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی20 1-7-2 اهمیت کشت بافت21 1-7-3 تولید اقتصادی22 1-8 انواع کشت در شیشه 23 1-9انواع کشت بافت گیاهی25 1-10 نقش های عناصر غذایی و علاءم کمبود ژن25 1-10-1 نیتروژن26 1-10-2 پتاسیم28 1-11 اثر غلظت های مختلف یک ماده بر رشد و نمو29 1-12اثر ازت بر رشد رویش گیاه31 1-13 اثر نوع ازت بر مقدار پروتئین گیاه33 1-14اثر نوع ازت بر کلروفیل کل گیاه34 1-15 روشهای کشت بافت گیاهی36 1-16استفاده کشت بافت برای ازدیاد گیاهان39 1-17 آشنا شدن کشت بافت گیاهی40 1-17-1 جداکشت ها40 فهرست مطالب عنوان صفحه 1-17-2 جداسازی و انکیباتور شدن-----------------------------------------------------------------41 1-17-3 محیط کشت-----------------------------------------------------------------------------41 1-18 ترکیبات محیط کشت بافت گیاهی------------------------------------------------------------42 1-19 تهیه ذخیره نیتروژن و مرفوژنز-----------------------------------------------------------------46 1-20 تعادل تغییرات آمونیوم-----------------------------------------------------------------------46 1-21 جنین زایی و رشد جنین----------------------------------------------------------------------49 1-22 جنین زایی زیگوتی-------------------------------------------------------------------------50 1-23 اطلسی-------------------------------------------------------------------------------------51 1-23-1 گیاهشناسی------------------------------------------------------------------------------51 1-23-2 تاکسونومی------------------------------------------------------------------------------ 54 1-23-3 آناتومی----------------------------------------------------------------------------------54 1-23-4 تولید اقتصادی--------------------------------------------------------------------------- 55 1-23-5 فرایند جوانه زدن-------------------------------------------------------------------------55 1-24-6 پاسخ اطلسی به روشن روز-----------------------------------------------------------------56 1-24 نقش های اکسانسین در نمو اطلسی------------------------------------------------------------56 1-25 اثرات آلودگی محیطی از ترافیکی جاده ای بر برگ های اطلسی-----------------------------------58 1-26 تکنیک های بافت گیاهی---------------------------------------------------------------------59 1-26-1 اصلاحات کشت بافت --------------------------------------------------------------------59 1-27 اثرات تعادل هورمون در مورفوژنز رشد جداکشت ها---------------------------------------------61 1-28پیش برنده های promotors ژن و مناطق کنترل در گل اطلسی------------------------------------65 فصل دوم:روش کار 2-1 ترکیبات سازنده محیط کشت------------------------------------------------------------------68 2-2 اجزاء تشکیل دهنده محیط کشت---------------------------------------------------------------70 2-3 مقادیر عناصر در محیط کشت------------------------------------------------------------------70 2-4 ضدعفونی کردن بذر ها و کشت بذرها----------------------------------------------------------72 ادامه فهرست مطالب عنوان صفحه 2-5 محله واکشت--------------------------------------------------------------------------------72 2-6 سنجش رنگیزه های فتوسنتزی------------------------------------------------------------------75 2-7 سنجش کربوهیدرات ها-----------------------------------------------------------------------76 2-7-1 اندازه گیری قند های محلول----------------------------------------------------------------76 2-7-2 اندازه گیری قند های نا محلول (نشاسته--------------------------------------------------------78 2-8سنجش پرولین--------------------------------------------------------------------------------79 2-9 سنجش فعالیت های آنزیمی -------------------------------------------------------------------81 2-9-1 سنجش آنزیم پراکسیداز--------------------------------------------------------------------81 2-9-2 سنجش آنزیم کاتالاز-----------------------------------------------------------------------82 2-10 سنجش پروتئین-----------------------------------------------------------------------------83 2-11 آنالیز رشد---------------------------------------------------------------------------------86 فصل سوم:نتیجه گیری 3-1 اثرات غلظت های مختلف نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم بر رشد جداکشت های دو گره ای-----------92 3-1-1 اثرات غلظت های مختلف نیترات آمونیوم بر رشد جداکشت های دو گره ای-----------------------92 3-1-2 اثرات غلظت های مختلف نیترات پتاسیم بر رشد جداکشت های دو گره ای------------------------93 3-2تغییرات شاخص رشد در گیاه 40 روزه تحت تیمار های غلظت نیترات آمونیاک و نیترات پتاسیم---------95 3-2-1 تغییرات وزن تر اندام هوایی-----------------------------------------------------------------95 3-2-1تغییرات طول ساقه--------------------------------------------------------------------------97 3-2-3 تغییرات وزن خشک اندام هوایی ------------------------------------------------------------99 3-2-4وزن تر کل برگ ها-----------------------------------------------------------------------101 3-2-5 تغییرات تعداد برگ-----------------------------------------------------------------------103 3-2-6 تغییرات وزن خشک کل برگ ها-----------------------------------------------------------105 3-2-7تغییرات طول میانگره ---------------------------------------------------------------------107 3-2-8 تغییرات سطح برگ ها--------------------------------------------------------------------109 3-2-9 تغییرات طول ساقه------------------------------------------------------------------------111 ادامه فهرست مطالب عنوان صفحه 3-2-10 تغییرات میانگین نسبت سطح برگ به وزن خشک کل گیاه(L.A.R) -------------------------- 113 3-2-10-1 تغییرات میانگین نسبت سطح برگ به وزن خشک کل گیاه(L.A.R)------------------------113 3-2-11تغییرات نسبت سطح ویژه برگی(S.L.A)--------------------------------------------------115 3-2-12 سرعت رشد نسبی(R.G.R)---------------------------------------------------------------116 3-2-13 میزان جذب خالص(N.A.R)-------------------------------------------------------------117 3-2-14 نسبت سطح برگی (L.A.R)--------------------------------------------------------------118 3-2- 15سرعت رشد گیاه (C.G.R)---------------------------------------------------------------120 3-2-16 وزن مخصوص برگ(SLW)-------------------------------------------------------------121 3-3 تغییرات بیوشیمیایی --------------------------------------------------------------------------123 3-3-1 تغییرات مقدار کلروفیل ها-----------------------------------------------------------------123 3-3-2 تغییرات مقدار پرولین در اندام هوایی--------------------------------------------------------128 3-3-3 تغییرات مقدار قند های محلول ونامحلول کل اندام هوایی----------------------------------------130 3-3-4 تغییرات میزان پروتئین های کل اندام هوایی----------------------------------------------------133 3-3-5 تغییرات فعالیت آنزیم-----------------------------------------------------------------------136 3-3-5-1 تغییرات مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز در اندام هوایی----------------------------------------136 3-3-5-2 تغییرات مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز در انداد هوایی-------------------------------------------138 ادامه فهرست مطالب عنوان صفحه فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری--------------------------------------------------------------------140 4-1 نتیجه گیری -------------------------------------------------------------------------------- 141 4-2 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر روی رشد گیاه -----------------------------144 4-3 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر میزان کلروفیل------------------------------145 4-4 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر میزان فند محلول و نامحلول--- ---------------148 4-5 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر میزان پرولین--------------------------------150 4-6 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر میزان پروتئین----- -------------------------151 4-7 اثر غلظت های مختلف نیترات آمونیوم ،نیترات پتاسیم بر میزان بر میزان فعالیت آنزیم های کاتالاز و پراکسیداز-------------------------------------------------------------------------------------- 153 4-8 نتیجه گیری کلی-----------------------------------------------------------------------------155 4-9 پیشنهادات ----------------------------------------------------------------------------------156 منابع--------------------------------------------------------------------------------------------158 پیوست------------------------------------------------------------------------------------------164 فهرست جداول عنوان صفحه فصل اول:کلیات تحقیق جدول1-1 ترکیب MS به ترکیبات اولیه زمان مقایسه شده است که گیاهان رشد بیشتری دارند--------------- 44 جدول 1-2 مثال های فواید و مضرات کل نیتروژن و NO3- و NH4+ در سطح پایین محیط شوری ------------47 جدول 1-3 مثال های از محتوای نیتروژن محیط MS،که نتیجه بهبودی رشد و مرفوژنز را دارد-----------------48 جدول1-4 شرایط کشت بافت برای جوانه زدن دانه ها و رشد اطلسی هیبریدا --------------------------------55 فصل دوم :روش کار جدول2-1 مقادیر عناصر ماکرو در محیط کشت---------------------------------------------------------71 جدول2-2 مقادیر عناصر میکرو در محیط کشت---------------------------------------------------------71 جدول2-3 مقادیر عناصر در محیط واکشت بدون نیترات پتاسیم--------------------------------------------71 جدول2-4 مقادیر عناصر در محیط واکشت بدون نیترات آمونیوم-------------------------------------------74 جدول 2-5 جذب های خوانده شده برای تهیه منحنی استاندارد قند های محلول و نا محلول--------------------- 77 جدول2-6 جذب های خوانده شده برای تهیه منحنی استاندارد پرولین---------------------------------------80 جدول2-7 جذب های خوانده شده برای تهیه منحنی استاندارد پروتئین---------------------------------------85 فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری جدول 4-1 محدوده کافی ترکیب های NH4NO3 و KNO3 ------------------------------------------14 فهرست نمودار ها عنوان صفحه فصل دوم :روش کار نمودار2-1 منحنی استاندارد قند های محلول و نامحلول----------------------------------------------------78 نمودار 2-2 منحنی استاندارد پرولین--------------------------------------------------------------------80 نمودار 2-3 منحنی استاندارد پروتئین------------------------------------------------------------------- 85 فصل سوم:نتیجه گیری نمودار3-1 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین وزن تر اندام هوایی---------------------------------96 نمودار3-2 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین وزن تر اندام هوایی----------------------------------96 نمودار3-3 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین طول ساقه-----------------------------------------96 نمودار 3-4 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین طول ساقه------------------------------------------98 نمودار3-5 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار تغییرات وزن خشک اندام هوایی---------------100 نمودار 3-6 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار تغییرات وزن خشک اندام هوایی----------------100 نمودار3-7 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین وزن تر کل برگ ها--------------------------------102 نمودار3-8 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین وزن تر کل برگ ها---------------------------------102 نمودار3-9 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین تغییرات تعداد برگ--------------------------------104 نمودار3-10 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین تغییرات تعداد برگ--------------------------------104 نمودار3-11 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار وزن خشک کل گیاه------------------------106 نمودار3-12 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار وزن خشک کل گیاه--------------------------106 نمودار3-13 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین تغییرات طول میانگره------------------------------108 نمودار3-14 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین تغییرات طول میانگره-------------------------------108 نمودار3-15 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین تغییرات سطح برگ ها----------------------------110 نمودار 3-16 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین تغییرات سطح برگ ها-----------------------------110 نمودار3-17 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین تغییرات طول ساقه--------------------------------112 نمودار 3-18 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین تغییرات طول ساقه---------------------------------112 نمودار3-19 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم برتغییرات میانگین نسبت سطح برگ به وزن خشک ------------- 114 ادامه فهرست نمودار ها عنوان صفحه نمودار3-20 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر برتغییرات میانگین نسبت سطح برگ به وزن خشک---------114 نمودار3-21 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر تغییرات نسبت سطح برگ LAR----------------------119 نمودار3-22 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر تغییرات نسبت سطح برگ LAR -----------------------119 نمودار3-23 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر تغییرات وزن مخصوص برگ---------------------------122 نمودار3-24 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر تغییرات وزن مخصوص برگ----------------------------122 نمودار3-25 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیل a -------------125 نمودار3-26 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیل a---------------125 نمودار3-27 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیلb--------------126 نمودار 3-28 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیلb--------------126 نمودار3-29 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیلa+b-----------127 نمودار 3-30 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر تغییرات نیترات آمونیوم بر میزان کلروفیلa+b------------127 نمودار3-31 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار میزان پرولین اندام هوایی ------------------129 نمودار3-32 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار میزان پرولین اندام هوایی---------------------129 نمودار3-33 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین میزان مقدار قند محلول کل اندام هوایی------------131 نمودار 3- 34 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین میزان مقدار قند محلول کل اندام هوایی------------131 نمودار3-35 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین میزان مقدار قند نا محلول کل اندام هوایی----------132 نمودار 3-36 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین میزان مقدار قندنا محلول کل اندام هوایی------------133 نمودار3-37 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار میزان پروتئین اندام هوایی------------------134 نمودار3-38 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار میزان پروتئین اندام هوایی-------------------135 نمودار3-39 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز اندام هوایی---------137 نمودار 3-40 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز اندام هوایی----------137 نمودار3-41 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر میانگین مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز اندام هوایی------------139 نمودار3-42 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر میانگین مقدار فعالیت آنزیم کاتالاز اندام هوایی-------------139 فهرست اشکال عنوان صفحه فصل اول :کلیات تحقیق شکل1-1تعدادی از محققین کشت بافت جهان --------------------------------------------------------- 9 شکل1-2شمایی از تاریخچه کشت سلول سلول و بافت گیاهی را نشان می دهد-----------------------------10 شکل1-3 سولفور---------------------------------------------------------------------------------- 27 شکل1-4 ارتباط تامین ترکیبات تغذیه ای بر رشد------------------------------------------------------- 30 شکل1-5 مراحل تبدیل تغییرات و آمونیوم به کلروفیل-------------------------------------------------- 35 شکل1-6 میکروگرافت ناحیه میانه-------------------------------------------------------------------- 51 شکل1-7 گونه های اطلسی-------------------------------------------------------------------------- 53 شکل1-8 فرمول ساختار هورمون های تمایز و رشد گیاهی-----------------------------------------------62 فصل سوم:نتیجه گیری شکل3-1 اثرات غلظت های نیترات آمونیوم بر گیاه----------------------------------------------------- 93 شکل3-2 اثرات غلظت های نیترات پتاسیم بر گیاه-------------------------------------------------------93 فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری شکل1-4 مسیر تولید کلروفیل از آمونیوم------------------------------------------------------------- 14 فهرست پیوست عنوان صفحه جدول(1 ):نتایج تجزیه واریانس کربوهیدرات محلول تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم -------160 جدول( 2): نتایج تجزیه واریانس کربوهیدرات نامحلول تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم------161 جدول(3 ): نتایج تجزیه واریانس پرولین تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------------------161 جدول(4 ): نتایج تجزیه واریانس پروتئین تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------------------162 جدول( 5): نتایج تجزیه واریانس پراکسیداز تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم----------------163 جدول(6 ): نتایج تجزیه واریانس کاتالاز تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم------------------163 جدول(7 ): نتایج تجزیه واریانس کلروفیلa تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم----------------164 جدول(8 ): نتایج تجزیه واریانس کلروفیلb تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-----------------165 جدول(9 ): نتایج تجزیه واریانسکلروفیلa+b تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------------165 جدول(10 ): نتایج تجزیه واریانس وزن خشک کل برگ تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-----166 جدول(11 ): نتایج تجزیه واریانس وزن خشک اندام هوایی تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم---167 جدول( 12): نتایج تجزیه واریانس وزن تر اندام هوایی تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------167 جدول(13 ): نتایج تجزیه واریانس وزن تر کل تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم---------------168 جدول(14 ): نتایج تجزیه واریانس طول میانگره تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------------169 جدول(15 ): نتایج تجزیه واریانس مساحت سطح تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم------------169 جدول( 16): نتایج تجزیه واریانس طول ساقه تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم---------------170 جدول(17 ): نتایج تجزیه واریانس سرعت رشد تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم--------------171 جدول(18 ): نتایج تجزیه واریانس برگ به وزن خشک تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------171 جدول(19 ): نتایج تجزیه واریانس نسبت برگی تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم--------------172 جدول(20 ): نتایج تجزیه واریانس وزن مخصوص برگی تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-----173 جدول(21 ): نتایج تجزیه واریانس جذب خالص تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم-------------173 جدول(22 ): نتایج تجزیه واریانس سطح ویژه برگ تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم----------174 جدول(23 ): نتایج تجزیه واریانس سرعت رشد نسبی تحت تیمار های نیترات آمونیوم و نیترات پتاسیم---------17 مقدمه گیاه اطلسی از تیره سیب زمینی (Solanaceae)است. به طور عمومی اطلسی ،از P.integrifolia مشتق می گیرند و P.axillaria و 2 تا از گونه های اطلسی بومی امریکا جنوبی هستند.شرح جغرافیایی شامل دما و ناحیه زیر خط استوا است. اطلسی یک گیاه زینتی که در جهان رویش پیدا می کند .تعداد زیادی کولتیوار با یک رنج وسیعی از رنگ واندازه و بذر هایی یک منبع مهم اقتصادی برای کشور ها بشمار می شود .در طبیعت ،گونه های اطلسی بیشتر طول سال با ساقه های علفی نمو پیدا می کند.گیاه اطلسی یکساله یا گیاه بادوام،افراشته ،بالارونده ،خوابیده ،یا ساقه های خوابیده ،ریشه های حقیقی در گره ها است.جام گل قیفی شکل است و لوله گرده 1/5تا 7 سانتی متر طول دارد.گلهای ارغوانی ،قرمز ( روشن یا نارنجی) یا صورتی هستند . (Northuyati,2008) اطلسی یک گیاه تزینی خوبی بشمار می رود.بزرگی تنوع و قابل موجود ردیف رنگ ها است.گیاهان زینتی منحصرا برای تولیدبهبود کیفیت هر یک رنگ گل و طول عمر ،شکل گیاهان ،تولید تنوع و اهداف اقتصادی است (Northuyati,2008. فنون کشت بافت گیاهی به به عنوانی ابزاری برای ازدیاد رویشی فراورده های مهم باغبانی بکار می روند.یکی از مهمترین عوامل ایجاد رشد و ریخت زایی در کشت بافت گیاهی ،مواد تشکیل دهنده محیط کشت می باشند.نیاز های اولیه سلول های گیاهی با گیاه کامل ,مشابهت زیادی دارند.اجزا تشکیل دهنده محیط کشت می توان به صورت عناصر پر مصرف ،ویتامین ها ،اسید آمینه و دیگر مواد نیتروژن دار ،قند ها ،مواد آلی ،مواد جامد و مواد تنظیم کننده رشد گروه بندی شده است.تهیه تهیه محیط کشت برای بیشتر کارهای ریزازدیادی مورد استفاده قرار می گیرند ،این دستورها در برگیرنده محیط های پیشنهاد شده که توسط موراشیگ و اسکوک ( محیط MS )،گمبورگ (محیط B5 )،گاتره ،هیلدربرانت ( محیط SH )همگی دارای مقادیر زیادی از عناصر پر مصرف می باشند ,در حالیکه سایر محیط های کشت عناصر پر مصرف کمتری دارند.(الناز بصیرت، 1386 ) کشت بافت گیاهی یک نام اختصاری برای کشت پروتوپلاسم protoplast culture ،و کشت سلول(cell culture) ،کشت بافت (tissue culture) وکشت اندام گیاهی ( organ culture) می باشد.این انواع کشت،به عنوان یک عامل عمومی ،شامل رشد مواد گیاهی عاری از میکروب در یک محیط گندزدایی شده ،مانند محیط کشت مواد غذایی ضد عفونی شده درون لوله آزمایش است .)فرشاد فر، 1375 ) اصطلاح کشت بافت گیاهی بطور کلی به کشت درون شیشه ای تمام بخش های گیاه ( تک سلولی ،بافت و اندام )در شرایط گندزدایی شده ،اطلاق می گردد. کشت بافت گیاهی برای برسی های گوناگون فیزیولوژی ،بیوشیمیایی ،ژنتیکی و مسا ئل ساختاری گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد.(Northuyati,2008) اهداف تحقیق: 1-بیشترین کاربرد عمومی تکنیک های کشت در شرایط ازمایشگاهی ریزازدیادی صرفه اقتصادی دارد.(Moges.Asmarad,2004) 2-تکنیک های کشت بافت گیاهی برای ازدیاد رویشی فراورده های مهم گلخانه ای و باغبانی بکار می روند 3-کشت بافت گیاهان دارویی و کم یاب و غیر بومی و جلوگیری از انقراض نسل ها 4- کشت بافت این امکان رو می دهد که اصلاح ژنتیکی و نژاد انجام دهیم 5-اشتغال و کار آفرینی 6-تکثیر و ریزازدیادی گیاهان 7-استفاده در مطالعه بافت شناسی و سلول شناسی و فیزیولوژی گیاهی است . هدف از این پژوهش بررسی اثر غاظت های NH4NO3وKNO3 در محیط های کشت در شیشه بر تغییرات تکوینی گل اطلسی در شرایط مذکور است.در محیط ها غلظت هر یک از ترکیبات ,NH4NO3برابر با 0,10,13,20,40 میلی مول برابر حد تعیین شده در محیط کشت در نظر گرفته شده است.و همچنین محیط ها غلظت هر یک از ترکیبات ,KNO3برابر با 0,9,12,18,36 میلی مول برابر حد تعیین شده در محیط کشت در نظر گرفته شده است آنالیز سنجش رنگیزه های فتوسنتزی ،سنجش کربوهیدرات ها،سنجش پرولین،سنجش فعالیت های آنزیمی شامل ( آنزیم پراکسیداز ها و آنزیم کاتالاز)،سنجش پروتین ها،آنالیز رشد انجام داده ایم نیتروژن یک ترکیب مهم از تعدادی ساختار مهم است،ژنتیک و ترکیبات متابولیک در سلول های گیاهی است.آن یک ترکیب جزء اصلی کلروفیل П است .از گیاهان که در انرژی نورانی به تولید قند از آب و دی اکسید کربن ( مثل فتوسنتز ) شامل شده است. همچنین جزء اصلی اسید آمینه ،که در ساختمان پروتین ها هستند.نیتروژن جزء انتقال انرژی است،مه مثل ATP( آدنوزین تری فسفات ) که اجازه به ما می دهد سلول ها به نگهداری و استفاده آزاد شدن انرژی در متابولیسم است. در پایان ،نیتروژن یک جزء معنی دار نوکلئوتیک اسید ها مثل DNA می باشد،ماده ژنتیک که اجازه می دهد سلول به رشد و تولید مثل است.نیتروژن نقش (با اسثنا فتوسنتز ) در جانوران را ایفا نقش می کند.بدون نیتروژن ،هیچ زندگی وجود ندارد. (Eckert.Don,2004) فصل اول کلیات تحقیق 1-1تاریخچةکشتبافتگیاهی فن نآوریباپیشنهادگوتیبهابرلنددررابطهباتوانمندیسلولدرآغازقرنبیستمشروعشد . هابرلندپیشنهادکردکهروشهاییبرایجداسازیوکشتبافتگیاهیبایدتوسعهیابدومتذکرشدکه،اگرمحیطوموادغذاییسلولهایکشتشدهدستکاریشود،آنسلولهامراحلنمورادررشدگیاهطبیعیتکرارخواهندنمود. دراارائه(توتی پتانسی)درسال 1838 شوانوشلیدن،تئوریتوتیپوتنسینمودند،براساساینتئوری،هرسلول،مستقلبودهودراصل،قادربهتولیدیکگیاه کاملاست . درواقع،تئوریآنها،پایهواساسکشتبافتوسلولگیاهیبود . اولینتلاشبوسلههابرلانتدرسال 1902 انجامشدولیاودرروشکشتبافتناموفقبود معذلکبینسالهای 1907 و 1909 هاریون،باروزوکارل،موفقبهکشتدرشیسهبافتهایحیوانیوانسانیشدند. گرچهپژوهشگران،تحقیقاتیرادرارتباطباکشتدرشیشه،بذورگیاهچههایارکیده،جنینواندامهایگیاهیانجامدادند؛ولیدرسال1939نوبکرت،گوستریت ووایت، برایاولینبارموفقبهتولیدگیاهاصلازکشتبافتشدند. بعدازجنگجهانیدوم،پیشرفتدراینزمینه،بسیارسریعبودونتایجباارزشومهمیبرایکشاورزی،جنگلکاریوباغبانی،به همراهداشت.(پیریک 1979 بوجوانیوهمکاران، 1986) شکل 1-1تعدادیازمحققین کشت بافت درجهان بهدلیلتأخیردرکشفهورمونهایگیاهی،کشتبافتگیاهی،پسازکشتبافتحیوانیوانسانی،شروعشد.اولینهورمونهایتنظیمکنندهرشدکهکشفشد،موفقیتبزرگیرابرایکشتبافتدرشرایطدرونشیشه ی،به دلیل وجودIAA اکسین است.کشفتنظیمکنندةرشدکینیتننوعیسیتوکینین ) درسال( 1955 انگیزهبیشتریحاصلنمود . ازآنزمانبهبعد،پیشرفتهایهمهجانبهایاتفاقافتاد . اینتحقیقات،ابتدادرفرانسهوآمریکا،وبعدازآن،درسایرکشورها،توسعهیافت . افزایشچشمگیرتعدادمحققینشاغلدراینرشتهدر 5 سالگذشته،دلیلیبراهمیتاستفادهازتکنیک کشتدرشیشهگیاهانعالیبرایمتخصصینبیماریهایگیاهیاست . ازآنجاکههنوزدستیابیبهنتایجعملیدرکشتبافت،برایمتخصصینزراعتواصلاحنباتاتبهسهولتامکانپذیرنیست،تعدادمتخصصینشاغلدراینرشته،بهتبعآن،وتعداد،شماییازتاریخچة - کارهایتحقیقاتی،یقیناًدرایندهافزایشخواهدیافت . شکل شمایی 1-2کشتسلولوبافتگیاهیرانشانمیدهد. شکل 1-2 شمایی از تاریخچه کشت سلول و بافت گیاهی را نشان می دهد برایجزئیاتبیشتردرموردتاریخچةکشتبافت،خوانندگانمیتوانندبهکتابهاومقالاتگوستریت ( 1959،1964،1983 )،استریت( 1973،1974 )،وگمبورگووتر ( 1975 ) مراجعهنمایند . درذیل،فقطبهذکرچندینموردمهم،پرداختهمیشود: 1892 :گیاهان،موادتشکیلدهندةاندامهارامیسازند،کهبهصورتقطبیپخشمیشوند. :1902 اولینکوششدرکشتبافتگیاهی )هابرلانت(. 1904:اولینکوشش،برایکشتجنینازبعضیگیاهانخانوادةشببو(هانیگ). :1909 امتزاجپروتوپلاستهایگیاهی،کهالبتهمحصولاتحاصله،نتوانستندزندهبمانند(کاستر). 1922 :جوانه زنیغیرهمزیستیبذورارکیده،درشرایطاینویترو(نادسون .( 1922 :کشتاینویترونوکریشه(رابین). 1925:کاربردعملیکشتجنین،درتلاقیهایبینگونهایکتان(لیباچ). :1929 کشتجنینکتان،بهمنظوراجتنابازناسازگاریهایحاصلازتلاقی)لیباچ.( 1934 :کشتبافتلایةزایندةچندیندرختودرختچهدرشرایطاینویترو،کهبهدلیلعدمکشفاکسیندرآنکشتموفقیتآمیزنبود(گوتریت). 1934 :کشتموفقیتآمیزریشههایگوجهفرنگی(وایت). 1936 :کشتبافتبازدانگانمختلف(دارو). 1939 :کشتموفقومداومکالوس(گوتریت،نابکرتووایت). :1940 کشتاینویتروبافتزایندةنارون،بهمنظورمطالعةتشکیلساقههاینابجا(گوتریت). 1941 استفادهازشیرنارگیلحاملعاملتقسیمسلولی ) برایاولینباربرای کشتجنینتاتوره)(واناوربیک). 1941 :کشتدرشیشهبافتهایگالتاجی(بران). 1944 :اولینکشتاینویترویتوتون،بهمنظورمطالعةتشکیلساقههاینابجا(اسکوگ). 1945 :کشتنوکساقههایجداشدةمارچوبه،درشرایطدرشیشه(لو). 1946 :ازکشتنوکساقهTropaeolum وLupinus تولیداولینگیاهکاملسرشاخه )بال). 1948 :تشکیلریشهوساقههاینابجادرتنباکوبهوسیلةتنظیمنسبتبهآدنین(اسکوگوسوا). :1950 باززاییاندامها،ازبافتهایکالوسدرسکویا Sequoia sempervirens(بال) :1952 تولیدگیاهکوکبعاریازویروس،بهوسیلهکشتمریستم(مورنومارتین). 1952 :اولینکاربردریزازدیادی(مورنومارتین). 1953:تولیدکالوسهایهاپلوئیدگونهGinkgo biloba ازدانةگرده )تولک(. 1954:کنترلتغییراتدرکاریولوژیورفتارهایکروموزومیدرکشتآندوسپرمذرت(استراس). 1954 :تولیداولینگیاهازیکسلولساده(مویروهمکاران). 1955 :کشفکینیتین،هورمونتقسیمسلولی(میلروهمکاران). :1956 مقدورشدنرشدگیاه،درسیستمهایتعلیقی)کشتشناور ) (چندلیتری .( بهمنظورتولیدفراوردههایثانویهبهوسیلهتالکونایکل)استبا( 1958 1957:مشاهدةتنظیمتشکیلارگانها(ریشهوساقه)بهوسیلهتغییرنسبتهایسیتوکینینبهاکسین(استوگومیلر). 1958 :باززاییجنینهایسوماتیک،بهوسیلةروشاینویترو،ازهستههایگونه Citrus ovules (محشووایورنگازومی). : 1958باززاییپیشجنین،ازتودةکالوسوکشتشناورسلولیگونه carota ) Daucusهویج)(رینرتواستوارد). 1959 :انتشاراولیندستورکارمفصل،دررابطةباکشتبافتگیاهی(گوتریت). :1960 اولینباروریموفقخشخاش((Papaver rhoeasدرآزمایش(کانت). 1960 :هضمآنزیمیدیوارههایسلول،بهمنظوربهدستآوردنتعدادزیادیپروتوپلاست(کوکنیگ). 1960:تکثیررویشیارکیده،بهوسیلةکشتمریستم(مورل). :1960فیلتراسیونسوسپانسیونسلولی،وجداسازیتکسلول)برگمن). :1962 تولیدمحیطکشتمعروفموراشیواسکوگ)موراشیواسکوگ(. 1964 :تولیداولینگیاهتاتورةهاپلوئید،ازکشتدانةگرده(گوهاومحشوواری). :1964باززاییریشهوساقه،ازبافتکالوسگونه )Populus tremuloidesمت(. : 1965 تمایزگیاهانتنباکو،ازسلولهایمنفردجداشدهدرریزکشتی culture (Micro و(اسیلوهیلدبرانت). 1967: القایگلدرگونة Lunuria annua بهوسیلةبهارهکردنورنالیزاسیوندرشرایطاینویترو(پیریک). 1967 :تولیدگیاهانهاپلوئیدازدانةگردةتنباکو(بورگینونیچ). 1969 :تجزیهکاریولوژیکیگیاهانباززاییشدهازکشتکالوستنباکو(ساکریستانوملجرز). :1969اولینجداسازیموفقپروتوپلاست،ازکشتتعلیقیگونة )Hapupappus gracili اریکسونوجانسون(. 1970:گزینشموتانتهایبیوشیمیایی،درشرایطاینویترو(کارلسون). 1970:استفادهازکشتجنین،درتولیدمونوپلوئیددرجو(کاشاوکاؤو). 1970:اولینامتزاجموفقیتآمیزپروتوپلاست(یاوروهمکاران). 1971:اولینگیاهانباززاییشدهازپروتوپلاست(تاکبوهمکاران). 1972 :دورگگیریبینگونهای،ازطریقترکیبپروتوپلاستدردوگونةتنباکو(کارلونوهمکاران). 1973:تشخیصتواناییسیتوکینین،درشکستندورةخوابدرقلمههایجربرا(پیریکوهمکاران). 1974 :القایشاخهدهیمحوریبهوسیلةسیتوکینیندرنوکساقةقطعشدةجربرا(موراشیوهمکاران). 1974: : باززاییهاپلوئیداطلسیPetunia hybrida ازپروتوپلاست(بیندینیگ) 1974 :تولیدهیبریدازامتزاجپروتوپلاستهایهاپلوئید(ملچرولابیب). 1974: انتقالزیستیبیولوژیکی (Biotransformation) درکشتبافت گیاه(رینهار). 1974: کشفعاملتولیدتوموربودنپلاسمیددر(Ti- plasmid) Ti- اگروباکتریوم(زاننوهمکاران،اربیکوهمکاران). 1975 :گزینشمثبت،ازنظرمقاومتکشتکالوسذرتبهقارچ maydiHelminthosporium (جنگنباخوگرین). 1976 :تشکیلساقه،ازسرشاخههایمیخکنگهداریشدهدرازتمایع(سیبرت) 1976 :دورگگیریبینگونهایبهوسیلةامتزاجپروتوپلاستگونههایP. Parodii وPetunis hybria (یاوروهمکاران). 1978 :دورگگیریسوماتیکیگوجهفرنگیوسیبزمینی(ملجروهمکاران). 1980 :استفادهازسلولهایکاملغیرمتحرک،برایانتقالبیولوژیکی دیجیتوکسینبهدیجوکسین(Digitoxin into digoxin) (الفرمنوهمکاران) 1981:استفادهازاصطلاحتغییراتبدنیهمانند تنوعسوماکلونال ) لارکینوسکوکروف). 1981: ایزوله کردن آکسوتروف(Auxotrophs) ازطریقبهگزینیدرتعداد زیادیازکلنیهایسلولیحاصلازپروتوپلاستهایهاپلوئیدگونه Nicotianaplumbagianifolia شدهباعواملجهشزا)سیدرووهمکاران(. 1982: امکانترکیبپروتوپلاستهابا لخت DNA ومتعاقباًانتقالژنتیکیتوسطجداشده ((کرنوهمکاران). 1982:امتزاجپروتوپلاستها،بهوسیلةمحرکهایالکتریکی(زیمرین). 1983 :دورگگیریسیتوپلاسمیبینجنسهادرتربچهوشلغم(بلیتروهمکاران). : 1984 انتقالسلولهایگیاهی،بهوسیله DNA پلاسمید(بازکوسکیوهمکاران). 1985:آلودگیوانتقالقطعاتبرگ،بهوسیله اگروباکتریوموباززاییگیاهانانتقالیافته(هدرچوهمکاران). 1-2تعریفکشتبافتگیاهی کشتبافتگیاهییکناماختصاریبرایکشتپروتوپلاست culture)(Protoplastوکشتبافت(Tissue culture)،کشتسلول(Cell culture) میباشد.اینانواعمختلفکشت،بهعنوانیککشتاندامگیاه(Organ culture)عاملعمومی،شاملرشدموادگیاهیعاریازمیکروبدریکمحیطگندزداییشده،مانندمحیطکشتغذاییضدعفونیشدهدرونلولةآزمایشمیباشد. درسالهایاخیرروشهایکشتبافت گیاهیبهیکابزاربسیارقویبرایتکثیروبهنژادیبسیاریازگونههایگیاهیتبدیلشدهاست. اصطلاح کشت بافت گیاهی در مورد تمام انواع کشت های استریل که در این ویترو انجام انجام می پذیرند بکار برده می شود.این کشت های پروتوپلاست ها،بافتها ،اندامها و جنینهای گیاهی و نیز کشتهای نو زایش و تولید گیاهچه ها درشرایط این ویترو می باشد . اصطلاح این ویترو جهت توصیف محیط کشت مصنوعی و استریل شده به کار برده می شود.از طرفی ،اصطلاح این ویو برای معرفی شرایط غیر استریل طبیعی ( شرایط باغچه و مرزعه ...) مورد استفاده قرار می گیرد.اصطلاح گیاهچههم برای توصیف گیاه استریلی به کار برده می شود که در این ویترو رشد کرده و دارای ریشه و جوانه مشخصی می باشد. کشتبافتمبتنیسهتواناییاصلیگیاهتبدیلشدهاست: -1توانمندی(Totipotency) قابلیتیاتواناییارثییکسلولگیاهیبرایرشدوتبدیلبهگیاهیکاملدرصورتتحریکمناسباست . قدرتباززاییتاکیدداردکهتماماطلاعاتموردنیازبرایرشدوتولیدمثلموجوددرداخلیکسلولقراردارد. اگرچهبهلحاظتئوریتمامسلولهایگیاهیدارایتوانمندیهستند،ولیسلولهایمریستمیبهترینسلولهاییهستندکهقادربهبروزاینتوانمندیمیباشند. -2عدمتمایز Dedifferentiation) )، بهمعنیظرفیتسلولهایبالغ،نسبت به کشتشرایطمریستمیوتولیدیکنقطةرشدجدیدمیباشد،کهباتمایزمجددکهقدرتسازماندهیوتشکیلاندامجدیدمیباشد،ادامهمییابد. -3 قابلیتیاآمادگی (Competency) ، قابلیتدرونزادیکسلولیابافت مشخصبهرشددرمسیریویژهراتوصیفمیکند. برایمثالسلولهاییکهازنظرجنین زاییدارایشایستگیهستندقادربهتوسعهبهجنینهایکاملاًفعالمیباشند. نقطةمقابلآنعدمقابلیتویاعدمصلاحیتمورفوژنتیکیاست.( محسنفرشادفر 1375) 1-1-3تکنیک های کشت بافت گیاهی را می توان عمدتا به پنج دسته طبقه بندی نمود.این دستجات بر اساس نوع مواد گیاهی استفاده پایه گذاری شده اند و شامل: 1-کشت کالوس:کشت دانه رست ها ( نشاها) یا قطعات جداکشت گیاهان بر روی محیط های حاوی آگار که منجر به تولید توده های سلولی آمورف می گردد را کشت کالوس می نامند. کشت سلولی :کشت سلولها در محیط های مایع( بدون آگار ) در ظرفهایی که معمولا با تکان دادن تهویه می شود را کشت سلولی می گویند. 3-کشت اندام :کشت اسپتیک جنین ،بساک ها (میکرواسپورها)،تخمدانها،ریشه ها،نو ساقه ها یا دیگر اندام هایگیاهان بر روی محیط های مغذی را کشت اندام می نامند. برخی از پژوهشگران ،جنین را به عنوان اندام طبقه بندی نمی کنند،زیرا جنین اتصالات آوندی با بدنه گیاه مادر نداشته و لذا کشت جنین را به صورت یک موضوع مجزایی مطرح می کنند. 4-کشت مریستم و ریخت زایی یا مرفوژنز :کشت اسپتیک مریستم های نو ساقه ها یا قطعات جداکشت دیگر گیاهان بر روی محیط های مغذی به منظور تولید گیاهان کامل را کشت مریستم و ریخت زایی می نامند. 5-جداسازی اسپتیک پروتوپلاست های گیاهان و کشت دادن آنها بر روی محیط های مناسب را کشت پروتوپلاست می گویند.( سلیمان افشاری فر ،1372) 1-4 فواید کشت بافت گیاهان دست نخورده و کامل: امروزه ،تکنیک های اولیه جهت تولید کالوس ،جای خود را به روش های پیشرفته در علم بیوشیمی و امور تجاری داده است.این تکنیک ها شامل کشت سلول و بافت گیاهی در مقیاس بزرگ ،کشت رویان ،تخمک ،بساک،جداسازی و همجوشی ( امتزاج)پروتوپلاست ،انتخاب سلول ،کشت جوانه ،کشت مریستم ،ریخت شناسی و ژنتیکی سلول ها و گیاهان است. 1-5 برخی از کاربردهای تکنیک ها کشت بافت و سلول: مهندسی بیوشیمی ،توان رشد سلول های گیاهی در محیط کشت مایع در مقیاس بزرگ را دارد تا بتوانند متابولیت های ثانویه ی گیاهی را به طور بالقوه از گیاهان دست نخورده تولید کنند. با تولید گیاهان دی هاپلوئید ،زمان دستیابی به گیاهان خالص (هموزیگوت ) کاهش می یابد تلاقی گونه ای خویشاوند ،باروش جداسازی پروتوپلاست و همجوشی (امتزاج) طبیعی ،امکان انتقال و تغییر نوین را در محصولات گیاهی را افزایش می دهد. انتخاب سلول باعث افزایش تعداد سلول های خاص با دیواره چوبی رشد یافته شده ،سبب افزایش مقاومت دیواره سلولی نسبت به علف کش ها می شود. استفاده از روش های کشت بافت مریستم و جوانه ،منجر به تولید مقادیر زیادی از سلول های خاص گونه های گیاهی مورد استفاده در باغبانی می شود. ریخت شناسی ژنتیکی سلول ها سبب رساندن اطلاعات ویژه به سلول ها می شود .در این بخش مزاحمت زیادی برای ژن های مادری وجود ندارد.( عبادی,1390) 1-6 موارد کاربردی کشت بافت گیاهی: در سالهای بعد از 1970مشخص گردید که تکنولوژی کشت بافت گیاهی دارای اهمیت بسزایی در کشاورزی وصنعت می باشد. ذیلا موارد کاربرد این تکنولوژی در دو بخش کشاورزی و صنعت به طور خلاصه درج گردیده است: الف- موارد کاربردی در کشاورزی مهمترین موارد استفاده در کشاورزی شامل: تکثیر تاگی یا غیر جنسی گیاهان پرورش هاپلوئید تولید گیاهان موتانت تولید گیاهان عاری از پاتوژن تولید گیاهان با اطلاعات پاتوژنی جدید کریوپرزرواسون یا منجمد کردن کشت های بافت گیاهی و تاسیس بانکهای ژن ب-موارد کاربرد ی در صنعت کاربرد های صنعتی شامل استفاده از کشت های سلولی معلق ( کشتهای سوسپانسیونی ) که توانایی سنتز و تولید نمودن مقادیر قابل توجهی از ترکیبات مفید هستند می باشند . این ترکیبات مفید شامل: داروهای آلکالوئیدی ضد موتور ترکیبات ضد میکروبی ویتامین ها حشره کش ها آنزیم ها مطبوع کننده های اغذیه شیرین کننده ها (سلیمان افشاری پور،1372) 1-7 -1اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی: تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماریتکثیروریزازدیادی گیاهان (micropropagation)تولید گیاهانهاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملا هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساکدست ورزی ژنتیک ودورگ گیری سوماتیکی با استفاده از الحاق پروتوپلاسما وهمچنین ایجاد تلاقی بین گونه ای در شرایط درون شیشه یکشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت های لوله مثل قند و کربن و نیز متابولیت های ثانویهایجاد گیاهان باخصوصیات جدید با استفاده از تنوع سوماکلونالنگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون شیشه ای استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاهان استفاده در مطالعات بافت شناسی ،سلول شناسی و فیزیولوژی (مباحث آزمایشگاهی) بیشترین کاربرد عمومی تکنیک های کشت در شرایط ازمایشگاهی ریزازدیادی صرفه اقتصادی دارد.(Moges,2004) کشت سلول گیاهی اغلب یک سیستم موثر به مطالعه اهمیت بیولوژیک متابولیت فعال سازی در تحت شرایط آزمایشگاهی است،برای تولید طبیعی برای فرایند زیستی کاربردی است.(Alsane,2005)) جاذبه دیدنی،سازگار با سایه اتاق ،قادر به گل دهی در نحت نور مصنوعی و آسانی در طول سال ازدیاد می تواند داشته باشد.در این اطلاعات ،تکنیک های ریز ازدیادی کاربردی به تولید شماری از نمونه جدید و واقعی گیاهان در یک روز زمانی کوتاه است. 1-7-2اهمیتکشتبافت بررسیومطالعهشرایطزیستازجنبههایمحیطی،اقلیمی،خاک،گیاهان،جانورانوامثالآنبرایانسانهایقرنحاضروقرنهایآینده،ایننکتةمهموقابلتوجهرایادآوریمینمایدکهانسانبرایبهبودشرایطحیاتخودبهویژهتولیدوتامینغذا،نیازمبرمبهاستفادهازفنآوریهایجد­یددرزمینه هایگوناگونبهویژه،علومگیاهیوکشاورزیدارد. افزایشجمعیتجهانوکاهشمنابعتولیدفرآوردههایگیاهیودامیدرجهانیکمشکلجدیواساسیاستکهدانشمندانراحداقلازدهةگذشتهتاکنونبهاینفکرترغیبنموده،تابااستفادهازشیوههایجدیددرحفظمحیطزیستوعدمتغییربنیادیدرطبیعت،دستبهتولیدبهتروبیشترمحصولاتگیاهیبزنند،یکیازاینروشهایمدرناستفادهازفنآوریکشتسلولوبافتهایگیاهیاستکهازاینطریقمیتواننسبتبهتکثیرگیاهانمختلفاعمازصنعتی،داروئی،مرتعیوکشاورزیاقدامنمود . ازطرفدیگرکشتبافتگیاهیمیتواندبسترمناسبیجهتحفظونگهداریگونههاوژنوتیپهایمادرویادرحالانقراضطبیعتبهعنوانمنابعباارزشژرمپلاسممحسوبشود . علاوهبراینتکنولوژیکشتسلولوبافتهایگیاهیدرسالهایاخیربهگونهایتوسعهیافتهاستکههماکنونبرایانتقالژنهایمطلوب،بهویژهژنهایایجادکنندةمقاومتنسبتبه آفاتوبیماریهایگیاهیکههرسالهبخشعظیمیازتولیداتگیاهیرانابودمیسازد،ازاینروشدرسطحگستردهاستفادهمیشود. بدیهیاستاصلاحگیاهانبهروشهایسنتی،علاوهبروقتگیربودن،دربسیاریاز مواردامکانپذیرنیستدرحالیکهتکنولوژیجدیدکشتسلولوبافتگیاهیاینراهرابهخوبیهموارساختهوبهپیشمیبرد-( محسنفرشادفر، 1372 ) 2-7-3تولید اقتصادی: تولید اقتصادی گیاهان زینتی در وسعت جهان رشد می کند .ارزش مالی به معنای افزایش بالایی که کمتر از 2 دهه و عامل اصلی برای ادامه رشد در خانگی و نشان بین مللی است. حدود 212.5 میلیون گیاه شامل 157 میلیون گیاهان زینتی تقریبا 78%گل تولیدات گزارش شده است. حدود 156 زینتی عمومی در محیط کشت در آزمایشاه های اقتصادی مختلفی در سراسر جهان ازدیاد می شود. سهم اصلی تولیدات در هلند (33%)،ژاپن (24%)،ایتالیا(11%)،USA(12%)،تایلند (10%)و دیگر کشور ها (14%) می باشد. مهمترین کشور های صادر کنندههلند(59%)،کلومبیا(10%)،ایتالیا )16%)،اسرائیل(4%) ،اسپانیا (2%)،کنیا (11%)،و دیگر کشور ها 18% است. 4کشور عمده صادر کننده هلند،کلومبیا،ایتالیا و اسرائیل در حدود 80%کسور برجسته جهان شناخته شده است. سهم کشورهای آفریقا ،آسیا و آمریکا لاتین کمتر از 20%است.گیاهان تزینی تقاضای برای تولید اقتصادی باغ خانگی و چشم انداز دارد.(Root,2006) 1-8انواع کشت در شیشه : دیفوسارد ( 1977 ) بطورکلیسهنوعکشتدرشیشه(اینویترو)رادرگیاهانعالیمعرفکردهاست. -1سازمانیافته : کشتگیاهتقریباًکامل(جنین،بذر)ویااندامهاکشتسازمانیافتهنامیدهمیشود،کهدرآن،ساختمانویژهومنظمگیاهیااندام،حفظمیشود،وتقریباًشبیهبهتکثیررویشیازطریققلمه،تقسیمکردن،ساقةروندهوجوانهجانبییاساقه،میباشد. اگرساختماناولیهگیاهیااندامحفظشود،نتیجهحاصل،باگیاهمادری،مشابهخواهندبود. 2-سازماننیافته : اگرسلولهاویابافتهاازیکبخشمنظمگیاهیتمایزنیافتهجداوسپسکشتشوند،رشدسازماننیافته(بهفرمکالوس)صورتخواهدگرفت . دراینجاممکناستکالوسبهصورتدستجاتیازسلولهاویاسلولهایمنفردباشد(کشتشناوریاتعلیق). رشدسازماننیافته،اساساًبراثرکاربردغلظتهایبالایاکسینویاسیتوکینیندرمحیطرشدبهوجودمیآید. درکشتهایسازماننیافته،ثباتژنتیکی،غالباًپاییناست. -3 حدواسط : ایننوعکشت،حدواسطدونوعقبلیمیباشد. سلولهاییکبافتیااندامجداشده،ابتدابهصورتتمایزنیافتهدرمیآیند،سپسدراثرتقسیم،بافتویا لایهایازبافتکالوسراتشکیلمیدهند،کهازآن،اندامهاییمثلریشهوساقهویاحتیگیاهکامل(جنیناولیهیاجنین)بهسرعتبهوجودخواهدآمد . ایننکتهرانیزبایددرنظرداشتکهساختمانهایمنظم،میتوانندازکشتهایسازماننیافتهبهوجودآیند . اینپدیده،بابکارگیریتکنیکهایویژهویابهطورخودبخودانجاممیشود . درهمهاینموارد،نتایجحاصل،کاملاًشبیهبهوالدینخودنیستند. هرگیاه،شاملاندامهایمتفاوتیاست،کههریکازایناندامهاازمعدودیبافتتشکیلشدهاند،وبافتهانیزبهنوبهخود،ازسلولهایاختصاصی،بهوجودآمدهاند. اگردیوارةاینسلولهاتوسطآنزیمهضمشود، پروتوپلاستحاصلمیشود . ازآنجاییکهگیاه،ازموادساختمانیبسیارمتفاوتیتشکیلشدهاست،انواعمختلفیازکشتدرشیشهنیزوجوددارد. -1 کشتگیاهکامل : یکبذر،ممکناستدرشرایطدرشیشه،کشتشود،ویکگیاهچهونهایتاًیکگیاهکاملتولیدکند. مثلارکیده. -2 کشتجنین: درایننوعکشت،جنینجداشده،پسازحذفپوستةبذر،کشتمیشود. 3-کشتاندامگیاهی : یکاندامجداشده،درشرایطدرشیشهرشدمیکند . درکشتاندام،انواعمختلفیمثلکشتمریستم،کشتنوکساقه،کشتریشه،کشتپرچموغیره،قابلتشخیصهستند . غالباًقسمتجداشدهبافتیااندام) بهعنوانقلمه)شناختهشده،وکشتقلمهنامیدهمیشود. 4-کشتکالوس : اگریکبافتتمایزیافتهجداشود،ودرشرایطدرشیشه،تولیدیکتودةسلولیتمایزنیافتهبنامکالوسنماید،اینپدیدهراکشتکالوسمینامند. -5 کشتسلول : کشتسلولهایمنفردکهبهکمکآنزیمهایابهروشهایمکانیکیازیکبافتگیاهی،کالوسیاتعلیقهسلولیبهدستمیآیند،کشتسلولنامیدهمیشود. -6 کشتپروتوپلاست : کشتپروتوپلاستهاییکهدراثرهضمآنزیمیدیوارةسلولیبهوجودآمدهاند،کشتپروتوپلاستمینامند.(محسن فرشادفر, 1372 ) 1-9 انواع کشت بافت: کشت بذر کشت جنین کشت کالوس کشت اندام( برگ،ریشه،ساقه،مریستم ودانه گرده) کشت سوسپانسیون سلولی کشت پروتوپلاست (آز کشت بافت ) 1-10 نقش های عناصر غذایی و علاءم کمبود آن برای اینکه ضروری بودن یک عنصر بودن یک عنصر برای گیاه اثبات شود،حداقل باید چند خصوصیت در آن وجود داشته باشد. بر اساس نظریه ارائه شده به وسیله آرنون و استوت (1939) ،عنصری برای گیاه ضروریست که : 1-کمبود آن مانع از تکمیل چرخه زندگی گیاه شود. 2-کمبود اختصاص به همان عنصر داشته و تنها با تامین همان عنصر بتوان به این مشکل فایق آمد 3-این عنصر صرف نظر از تاثیر اصلاحی آن بر شرایط نامطلوب شمیایی یا میکروبی خاک ،نقش تغذیه ای داشته باشد.( تایز وزایگر، ) عناصر معدنی پرمصرف ازت،فسفر،گوگرد،پتاسیم،منیزیم و کلسیم. عناصر معدنی کم مصرف آهن ،منگنز،روی،مس،بور،مولیبدن و کلر. عناصر معدنی سدیم،سیلیس و کبالت. 1-10-1نیتروژن : هر چند که تقریبا 80 درصد اتمسفر شامل نیتروژن است ،فقط برخی گونه های پروکاریوت مانند باکتری ها می توانند به طور مستقیم نیتروژن گازی را مورد استفاده دهند. بیشتر گیاهان نیتروژن را از محلول خاک اغلب به صورت یون نیترات معدنی (NO3-) و در موارد کمتری به صورت یون آمونیوم (NH4+)جذب می کنند.سپس در گیاه،(NO3-) قبل از ورود به داخل آمینو اسیدها،پروتئین ها وسایر مولکول های نیتروژنی به (NH4+)احیا می شود.نیتروژن اغلب محدود کننده ترین عامل در کشاورزی است. بسیاری از گیاهان مانند ذرت به (مصرف کننده های ) معروف اند و نیاز به کاربرد بسیار زیاد کود نیتروژن دارند.ساخت و توزیع کود های نیتروژنی برای کشاورزی ،به لحاظ هزینه های مالی و انرژی فرایند های بسیار پرخرج است. نیتروژن یکی از اجزای تشکیل دهنده بسیاری از مولکول های مهم از قبیل پروتئین ها،اسید های نوکلئیک،برخی هورمون های معین (از قبیل ایندول- 3-استیک اسید و سیتوکینین)وکلروفیل است.بنابراین ،جای تعجب نیست که بیشتر علائم کمبود نیتروژن شامل رشد تدریجی و کاهش یافته و زردی عمومی برگ هاست. نیتروژن در گیاه بسیار متحرک است.وقتی برگ های مسن تر زرد شده و می میرند،نیتروپن ،عمدتا به شکل آمین ها وآمیدهای محلول ،از این برگ ها منتقل شده و به برگ های جوان تر و در حال رشد سریع صادر می شود.بنابراین علائم کمبود نیتروژن عموما ابتدا در برگ های مسن تر ظاهر می شود و تا وقتی کمبود شدید در برگ های جوان تر مشاهده نمی شود.در این حالت،برگ های مسن تر کاملا زرد شده یا می سوزند و می ریزند.در شرایط تنش نیتروژن در بسیاری از گونه ها رنگدانه های آنتوسیانین تجمع می یابند و موجب پیدایش رنگ ارغوانی در ساقه ،دمبرگ ها و سطح زیرین برگ ها می شود.علت دقیق تجمع آنتوسیانین در گیاهان مواجه با کمبود شدید نیتروژن معلوم نیست.دلیل آن ممکن است تولید بیش از حد ترکیبات کربن باشد که ،در غیاب نیتروژن ،برای ساخت اسید های آمینه و سایر ترکیبات نیتروژن دار قابل استفاده نیستند. زیادی نیتروژن موجب رشد بیش از حد قسمت هوایی و نسبت بالای قسمت هوایی به ریشه می شود و در بیشتر مواقع شروع گلدهی را در محصولات کشاورزی به تاخیر می اندازد.به طور مشابه ،کمبود نیتروژن ،گلدهی سریع را تحریک می کند. نقش نیتروژن در گیاهان: گیاهان بوسیله نیتروژن در اتمسفر احاطه شده است،و سطح زمین بوسیله هزاران پوند از نیتروژن پوشیده شده است.زیرا گاز نیتروژن اتمسفر در مولکول (N2) نیتروژن بی اثر است.این نیتروژن مستقیما قادر به دسترس گیاهان نیست،که نیازمند رشد و نمو و تولید مثل است.سلامت گیاهان اغلب محتوای 3-4درصد نیتروژن بافت زمین اس شکل1-3 :سولفور نیازمند برای سنتز ویتامین ها است و تشکیل شده از اسید آمینه معین که بلوک های ساختاری از پروتئین ها ساخته شده است .بدون پروتئین ها ،گیاهان میمیرند. سولفور برای سنتز ویتامین ها و عضو تشکیل دهنده آمینواسید است که ساختمان از شکل پروتین ها را می سازد.این بالاترین غلظت از تغذیه کربن است ،هیدروژن و اکسیژن است. نیتروژن یک ترکیب مهم از تعدادی ساختار مهم است،ژنتیک و ترکیبات متابولیک در سلول های گیاهی است.آن یک ترکیب جزء اصلی کلروفیل П است .از گیاهان که در انرژی نورانی به تولید قند از آب و دی اکسید کربن ( مثل فتوسنتز ) شامل شده است. همچنین جزء اصلی اسید آمینه ،که در ساختمان پروتین ها هستند.نیتروژن جزء انتقال انرژی است،مه مثل ATP( آدنوزین تری فسفات ) که اجازه به ما می دهد سلول ها به نگهداری و استفاده آزاد شدن انرژی در متابولیسم است. در پایان ،نیتروژن یک جزء معنی دار نوکلئوتیک اسید ها مثل DNA می باشد،ماده ژنتیک که اجازه می دهد سلول به رشد و تولید مثل است.نیتروژن نقش (با اسثنا فتوسنتز ) در جانوران را بازی می کند.بدون نیتروژن ،هیچ زندگی وجود ندارد . (Eckert.Don,2004) 1-10-2پتاسیم: پتاسیم به صورت یک کاتیون تک ظرفیتی،K+،موجوداست.در عملیات کشاورزی ،پتاسیم معمولا به صورت پتاس(کربنات پتاسیم،K2CO3)به کار می رود.پتاسیم برای بیشتر گیاهان به مقدار زیاد لازم است.خاک های شنی با کمبود مداوم این عنصر مواجه اند،زیرا بسیار محلول است و به آسانی از خاک های شنی شسته می شود.یون پتاسیم در فعال کردن تعداد زیادی از آنزیم ها،بخصوص آنهایی که در فتوسنتز و تنفس دخیل اند،نقش دارد.در ضمن ،سنتز پروتئین و نشاسته نیز تحت تاثیر کمبود پتاسیم قرار دارد.پتاسیم،همانند سدیم در بافت های حیوانی ،نقش مهمی در تنظیم اسمزی دارد. حرکت یون پتاسیم عاملی اساسی در حرکات گیاهی،مانند باز و بسته شدن سلول های نگهبان روزنه ها و حرکات خواب یا تغییرات روزانه در آرایش برگ هاست. برعکس سایر درشت مغذی ها،به نظر می رسد که در گیاه نقش ساختمانی ندارد،اما همانند نیتروپن و فسفر به شدت قابل انتقال است .علائم کمبود ابتدا در برگ های مسن تر ظاهر می شود این علائم،بخصوص شامل لکه ای شدن یا لکه زردی است،که در نهایت به نکروزه شدن (نقاط بافت مرده )در حاشیه برگ منجر می شود.در تک لپه ای ها،بویژه ذرت و سایر غلات ،زخم های نکروزه از قسمت های پیر تر نوک برگ شروع می شوند وبه تدریج در طول حاشیه ها به سمت سلول های جوان تر نزدیک قاعده برگ پیشرفت می کنند.ساقه ها کوتاه و ضعیف می شوند و حساسیت به پوسیدگی ریشه افزایش می یابد.نتیجه اینکه گیاهان مواجه با کمبود پتاسیم به سادگی ورس می کنند (ویلیام ج.هاپکینز،1999( . 1-11 اثر غلظت های مختلف یک ماده بر رشد و نمو: برای مطالعه اثر غلظت یک عنصر بر رشد و نمو یک گیاه تدکیبی را که عنصر مورد مطالعه جزء آن است انتخاب کرده آن را با غلظت های مختلف آن گیاه اضافه می کنند ،سپس رشد و نمو گیاه را در طول زمان اندازه گیری کرده و منحنی تغییرات آن را نسبت به غلظت رسم می کنند ( روش یک فاکتوری ) منحنی تغییر ها ر رشد و نمو به طور عموم سیگموئیدی و سه منطقه ی است ( شکل 1): الف:منطقه غلظت های ناکافی یا کمبود(Deficient Range ) که در آن شیب منحنی مثبت و قابل توجه می باشد. ب:منطقه غلظت های مناسب یا محدوده کافی Adequat) َ ( Range که در آن منحنی به تقریب افقی شده،رشد و نمو به ماکزیمم می رسد و افزایش غلظت اثری بر آن ندارد. ج-منطقه غلظت های بیش از اندازه که به ازاء آن،رشد و نمو کاهش می یابد.این محدوده را منطقه سمی شدن (Toxic Range) می نامند. (عبادی و فعلی،1389) شکل 1-4 ارتباط تامین ترکیبات تغذیه ای بر رشد در بسیاری از موارد دیده می شود که به تقریب در بخش میانی غلظت های غیر کافی (کمبود )منحنی ،اندکی تغییر جهت داده،از اثر غلظت بر رشد و نمو ،اندکی کاسته می شود.این منطقه از منحنی را نقطه عطف و غلظت عنصر در این حالت غلظت بحرانی (Critical Concentration) می نامند. (Maschner,1989) 1-12 اثر ازت بر رشد رویشی گیاه: Rios در سال 2001 نشان داد که وقتی نیترات و آمونیوم بعنوان منابع ازت مورد استفاده قرار می گیرند اثرات متفاوتی را بر رشد رویشی و ترکیبات شیمیایی گیاه ایجاد می کنند. با مطالعاتی که این افراد بر روی گیاه ذرت و آفتابگردان انجام دادند مشاهده کردند که در هر دو گروه میزان رشد بخش هوایی و ریشه در تیمار آمونیوم نسبت به تیمار نیترات کمتر می باشد و میزان تجمع ماده آلی در تیمار نیترات بیشتراز تیمار آمونیوم می باشد.همچنین در هر گروه نسبت وزن بخش هوایی به ریشه در تیمار آمونیوم بیشتر از تیمار نیترات می باشد یعنی آمونیوم رشد بخش ریشه را بیشتر از بخش هوایی می کند. گیاهان تغذیه شده با نیتروژن نیتراتی در مقایسه با نیتروژن آمونیومی رشد بهتری داشته اند. مطالعات بر روی گیاه سویا نشان داده است که وزن خشک تجمع یافته در سیستم ریشه ای گیاهی که با آمونیوم تغذیه شده است 18% کمتر از گیاهی که با نیترات رشد نموده است وی علت کاهش رشد ریشه با تغذیه آمونیومی را انتقال CH2o از ریشه به بخش هوایی،همراه با تولید اسید آمینه بوسیله تثبیت آمونیوم می داند (فعلی،1389) اثر متفوت بر رشد به لحاظ محل هایی که گیاه آن ها را تثبیت می کند نیز می باشد.بیشترین فعالیت نیترات ردوکتاز در بخش هوایی صورت می گیرد و نیترات عمدتا در برگ ها احیا می شود(Lewis,1983) و قند های موجود در بخش هوایی برای تثبیت نیترات به کار می روند و تغذیه گیاه با نیترات موجب می شود که مقدار بیشتری از قند های موجود در ریشه جهت رشد مورد استفاده قرار گیرد(Lauchli,1983). از طرفیHageman در سال 1984نشان داد که،آمونیوم بیشتر در ریشه ها تثبیت می شود،در هنگام تغذیه قند های موجود در ریشه به مقدار زیادی تامین کننده انرژی و اسکلت کربنی مصرف می رسند ولی ادامه عمل چرخه TCA نیاز به این دارد که جای مواد متابولیکی مصرف شده مذکور دوباره پر شود،تامین و پر شدن جای این مواد متابولیکی سبب مصرف شدن هیدرات کربن و مشتقات آن می شود.این ترکیب ها اسکلت های کربن را برای بیوسنتز اسید های آمینه تامین می کنند و به این ترتیب تثبیت ازت معدنی سبب کاهش ذخایر کربوهیدرات های گیاه می گردد.دلیل دیگر اینکه برای احیاء نیترات و نیتریت و همچنین تثبیت آمونیاک ،نیاز به نیروی احیا کننده می باشد و اگر نیروی احیا کننده از فعل و انفعالات تنفسی تولید شود انجام این عمل بر اثر اکسیداسیون هیدرات های کربن و مشتقات آن خواهد بود اگر نیروی احیا کننده از فعل و انفعالات نوری فتوسنتز حاصل شود در این صورت مجموعه سیستم فتوسنتز ،مقدار کمتری co2 را احیا و تبدیل به هیدرات کربن خواهد کرد به این ترتیب در واقع نیاز به نیروی احیا کننده در تثبیت ازت معدنی سبب می شود که هیدرات کربنی که قبلا در سلول وجود داشته یا کربوهیدراتی که احتمالا در آینده سنتز خواهد شد کاهش یابد.چنانچه کود های شیمیایی ازته به مقدار زیاد به گیاهان زراعی داده شود در برگ های آن ها نسبت به ریشه هایشان مصرف کربوهیدرات ها شدید تر خواهد بود.مقدار ازتی که در اختیار ریشه ها قرار داده می شود،یا به صورت نیترات در مورد کودهای نیتراتی ویا به فرم گلوتامین تولید شده بوسیله ریشه از کود های آمونیاک دار،به سرعت از ریشه به برگ منتقل می گردد.در برگ هیدرات های کربن در مرحله فتوسنتز ساخته می شوند.تثبیت نیترات به اسید های آمینه (یا تبدیل گلوتامین به اسید آمینه)سبب کاهش ذخایر کربوهیدرات ها در برگ می گردد.این کاهش ذخایر کربوهیدرات ها سبب کاهش مقدار موتد قندی قابل انتقال از طریق آوندهای آبکشی به ریشه ها می شود.چون ازت نیتراته در گیاهان نسبت به آمونیاک با سرعت کمتری تثبیت می گردد و به همین علت استفاده از نیترات نسبت به آمونیاک ،به میزان کمتری مقدار هیدرات کربن را کاهش می دهد.تثبیت آمونیاک در گیاهان در شرایطی که مقدار هیدرات کربن در آن ها قبلا کاهش یافته است،حتی منجر به تهی شدن و کاهش بیشتر ذخایر کربوهیدرات در گیاه خواهد شد.دادن مقادیر آمونیاک بعنوان کود ازته به گیاهانی که مقدار هیدرات کربن آن ها کم است.ممکن است حتی سبب ایجاد مسمومیت ناشی از آمونیاک شود که بعلت انباشته شدن مقدار زیادی یون های آمونیاک تثبیت نشده در گیاه است.(فعلی,1389) مقدار قند گیاه خصوصا در ریشه ها به فعالیت فتوسنتزی گیاه بستگی دارد و نقش موثری در تغذیه نیتروژنی گیاه بازی می کند،زیرا بوسیله همین قندهای محلول،اسیدهای ستونی ساخته شده و آنگاه در ترکیب با آمونیاک،اسید های آمینه را می سازند و چون جذب و تحلیل آمونیاک سریع تر از یون نیتراتت صورت می گیرد و قند بیشتری در این راه مصرف می شود به همین علت عوارض کمبود قندظاهر شده و سنتز سلولز صورت نمی گیرد و در نتیجه استقامت گیاه کاهش می یابد.و از طرفی چون یون آمونیوم نمی تواند بعلت کمبود قند در فعل و انفعالات متابولیسمی داخل شود در داخل سلول انباشته شده و ایجاد مسمومیت می نماید.(فعلی،1389) Lim و همکاران در سال 1990نیز بیان کردند که اثر ساقه بر روی جذب نیتروژن ناشی از تولید قندها و میزان انتقال آنها از بخش هوایی به ریشه می باشد. 1-13اثر نوع ازت بر مقدار پروتئین گیاه افزایش مقدار آمونیوم در محیط بعلت خاصیت سمی آن سبب ایجاد تنش می شود و میزان پروتئین خالص ممکن است در نتیجه ممانعت یا تحریک تولید mRNA و ترجمه آن صورت گرفته باشد.بیشتر پروتئین ها به صورت یک عکس العمل فوری گیاه به محیط (دما،تنش اسمزی،زخم و...)ظاهر می شود(Singh,1985). شواهد وجود دارد که نشان می دهد ریشه های لوبیای سویا رشد یافته در انواع تنش شوری ممکن است پروتئین های مختلفی را سنتز نمایند(Kahance,1968).جذب ازت عمدتا در گیاهان با افزایش نسبت آمونیوم به نیترات افزایش می یابد و جذب آمونیوم نسبت بهنیترات با صرف انرژی کمتر صورت می گیرد.همچنین مراحل ورود آمونیوم به نیترات به ترکیبات اسید آمینه سریع تر و کوتاهتر از نیترات می باشد.بطور عمده در تیمار با آمونیوم نسبت به نیترات غلظت نیتروژن بخش هوایی افزایش می یابد که دلالت بر کارایی بیشتر آمونیوم داردShelp,1987)). 1-14اثر نوع ازت بر کلروفیل کل گیاه برگ مانند سایر اندام های گیاهی پیر می شود.پیری برگ مرحله ای است که در طول زندگی برگ بیش از ریزش و مرگ رخ می دهد.این مرحله همراه با مراحل فیزیولوژی دیگر،بخشی از برنامه های تکوینی گیاه است که اشاره به هماهنگی،تجلی و بیان تعداد زیادی ژن دارد.برگ پیش از پیری از منابع فتوسنتزی استفاده می کند و به محض آغاز پیری،دستگاه های فتوسنتزی تخریب می شوند.در ضمن درشت مولکول ها نیز شکسته شده و مواد سازنده آنها آزاد می شود.از دست دادن رنگیزه فتوسنتزی ،قابل مشاهده ترین تغییرا در ارتباط با آغاز پیری در برگ ها می باشدمعمولا کیفیت از دست دادن کلروفیل ،بعنوان مقیاسی از پیشرفت پیری مورد مطالعه قرار می گیرد.در بیشتر گیاهان همزمان با پیری سطح کلروفیل a,b نزول می یابد و کاهش در نسبت کلروفیل a به کلروفیل b رخ می دهد.معولا محتوای پیگمان های کاروتنوئید کاهش می یابد و رنگ برگ به زردی می گراید.بعلت اینکه نسبت کلروفیل به محتوای کاروتنوئید کاهش می یابد،به طور نسبی جذب نور فتوسنتزی در کارتنوتید ها افزایش می یابد(Lorene,1994). نیتروژن یکی از عناصر مهم در ساختار کلروفیل می باشد در نتیجه تغییر در میزان و نوع ترکیبات نیتروژنی تاثیر بسزایی بر روی مقدار کلروفیل دارد.مثلا در مطالعاتی که بر روی گیاه گندم انجام شد،مشاهده شد که مصرف نیتروژن امونیومی سبب بروز پیری زودرس در گیاه گندم(عارضه پژمردگی)ومصرف نیتراتی مایع بروز آن می گردد،نتایج بدست آمده از اندازه گیری کلروفیل محوای برگ تحت تیمار آمونیومی و نیتراتی در برگ گندم نشان می دهدکه تغذیه گیاه بانیتروژن نیتراتی موجب افزایش کلروفیل(کلروفیلaوکلروفیل کل)هم در برگ های پیر و هم در برگ های جوان می شود. مقایسه مصرف نیتروژن نیتراتی و نیتروژن آمونیومی مؤید آن اس که مقدار کلروفیل محتوای برگ در شرایط مصرف نیتروژن نیتراتی بیش از نیتروژن آمونیومی است.با توجه به مقادیر کلروفیل a,b و کلروفیل کل در برگ های جوان و برگ های پیر،می توان گفت که میزان کلروفیل محتوای برگ در هردو تیمار با افزایش سن به طور معنی داری کاهش می یابد. مراحل تبدیل نیترات وآمونیوم به کلروفیل به شرح شکل )1-2)است.(Harborne,1997) شکل 1-5 مراحل تبدیل نیترات و آمونیوم به کلروفیل 1-15روش کشت بافت گیاهی: کشت بافت گیاهان علم رشد سلول گیاهی است،بافت و ارگان ها از گیاهان در محیط کشت ساختگی مجزا می کنند.آن شامل تکنیک های و روش های استفاده تحقیق در تعدادی گیاهشناسی و چندین موضوع است. قبل از شذوع شدن ازدیاد گیاهان با روش های در محیط کشت بافت است،این روش های در این ماده گیاهان می تواند رشد و استقرار در لوله آزمایش است. تکنیک های برای کشت شرایط آزمایشگاهی ماده ی گیاهان و نشان می دهد که اطلاعات می تواند بدست آورد. هر دو اندامی وغیر غیر اندامی در شرایط ازمایشگاهی امکان رشد دارد رشد اندام شرکت می کند بسوی تولید یایک ساختار مشخص استقرار می یابد. آن رخ می دهد هنگامی که اندام های گیاهان در هر رشد و ریشه ها یا جوانه ها ( مریستم راسی)،دمبرگ ابتدایی،جوانه های جوانه های جوان گل ها یا میوه های کوچک ،به محیط کشت انتقال می دهند و ادامه به رشد با ساختارشان نگه داشته می شوند. رشد که مرتبط سازمان یافتگی است همچنین رخ می دهد هنگامی که اندام ها ایجاد می شود. این ممکن است رخ می دهد در شرایط آزمایشگاهی که مستقیما روی یک اندام یا روی یک قطعه بافت در کشت ( یک جدا کشت ) است،یا در طول کشت قبلا بافت بدون سازمان یافتگی است. این فرایندنو تشکیلات اندام ارگانزوژنز یا مرفوژنز ( از شکل نمو پیدا می کند) نامیده می شود 1- رشد بدون سازمان یافتگی رشد بدون سازمان یافتگی به ندرت در طبیعت یافت می شود ،اما کاملا رخ می دهد هنگامی که قطعه ای از گیاهان در شرایط آزمایشگاهی کشت داده می شود.این سلول ترکیب می شود ،که پس از آن شکل بگیرد. به طور نمونه فقدان تعدادی ساختاری شناسایی و محوای فقط شماری محدودی از انواع اختصاصی و سلول های یاف شده در گیاهان دست نخورده و تشخیص داده می شودتشخیص سلول که در نمو پیدا می کند از (مرفولوژی) و یا ساختار (فیزیولوژی) است. 2-کشت بافت ساختار کشت سازمان یافتگی کشت ارگان در یک مرحله عمومی برای انواع کشت استفاده می شود هر یک از رشد می تواند پی در پی نگداشته است. شامل ضد عفونی ،جداسازی از هر گیاه و در ساختار معین برگ پریموردیااست،گل های رشد نکرده و میوه های و رشدشان در شرایط آزمایشگاهی است.برای این مفهوم ازدیاد گیاهان ،مهمترین انواع کشت اندام ها هستند. کشت مریستم ،در رشد خیلی کوچک چوانه رأسی هر مرکب از سر راسی یا بدون یک یا دومی برگ پریموردیا برش زده می شود. نوک جوانه ها به طور نمونه رشد می کند و یک جوانه منفرد می دهد. نوک جوانه ها ،یا کشت جوانه ،از برش نوک جوانه یا غنچه ه شروع می شوند،بزرگتر از نوک جوانه به کشت مریستم کاربرد دارد و چندین برگ پریموردیادارد. این نوع جوانه معمولا کشت داده می شود در هر یک مسیرهای تولید جند تایی است. کشت گرهک ها از غنچه های ضلعی جدا می شود هر یک روی یک قطعه کوچک بافت ساقه کشیده می شود ،قطعات ساقه به طور منفرد یا چند تایی کشیده می شود و ممکن کشت داده شود. هر غنچه به تهیه جوانه منفرد رشد شود. کشت ریشه ها ،اتصال جف جوانه ها :سیستم شاخی شدن ریشه ها ممکن است فراهم کنند. کشت جنین ،جایکه باور ساختن یا غیر باور ساختن زیگوت ( دانه) جنین ها از نمو دانه یا میوه تشریح می کنند و در آزمایشگاهی کشت می دهند که آنها به سوی نشا رشد می کند. کشت جنین نسبتا جدا از جنین زلیی سوماتیک است. 3- کشت بافت بدون سازمان یافتگی کشت بافت عموما استفاده شده دریک مرحله جامع به شرح تمام انواع کشت بافت گیاهی در شرایط آزمایشگاهی است.در محل نوع کشت عموما ثبت شده است: کشت کالوس ( یا بافت) رشد و جایگاه بزرگی بدون سازمان یافتگی توده سلول است،که رشد می ند از همپایه و مختل شدن رشد اندام ها کوچک گیاهان است،قطعه ای از بافت یا سلول کشت داده است. کشت سوسپانسون یا سلول :همچنین باتحریک سلول های گیاهان و انبوه سلول های کوچک انجام می شود. که گاز دار کردن محیط مایع است. کشت پروتوپلاسیت:کشت سلول های گیاهی که بدون یک دیواره سلولی جدا می شود. کشت پرچم:کشت کامل پرچم ها محتوای میکروسپور های نارس گرده است. این موضوع معمولا گیاهان هاپلوئید با اطلاعات جنین های سوماتیک مستقیما از پالن ها بدست می آورد یا گاهی اوقات بوسیله ارگانژنز از طریق کالوس ها است. کشت های پالن از هر پالن که متفاوت از پرچم شروع می شود. 1-16 استفاده کشت بافت برای ازدیاد گیاهان: هدف از ازدیاد گیاهان از طریق کشت بافت ،ریزازدیادی نامیده می شود گیاهان از کشت بافت ریز گیاه نامیده می شود و می تواند از کشت بافت در 3 روش مشتق می شود: از بیشتر جوانه زدن جوانه ها یا جوانه های قدیمی (مریستم ها) که به رشد می انجامد و proliferate است. به دنبال مورفوژنز جوانه ها هنگامی که جوانه های جدید موجب می شوند به بافت بدون سازمان یافتگی یا مستقیما از جداکشت بافت گیاهان مادر است. از میان این تشکیلات جنین های سوماتیک که مانند دانه های جنین های گیاهان دست نخورده ،و می توانن به نشا ها در چند روش رشد می کنند.این فرایند به جنین زایی سوماتیک نامیده می شوند. به گیاهان بوسیله نخستین و دومی این روش ،لازم به تیمار جوانه ها از یک اندازه کافی مثل قلمه زدن پرورش می دهند و به تولید ریشه می انجامید. اشتتاق گیاهان جدید از سلول ها،که بطور طبیعی فرایند باز شدن را ندارند،نشان می دهد زندگی را تمایز یافتن سلول های گیاهان ممکن است دلالتی بر توتی پتانسی و غیره می باشد.آنها هر یک ظرفیت پنهانی به تولید گیاه کامل نگه می دارد. توتی پتانسی یک بخش ویژه از سلول در بافت جدید و مریستم است .آن می تواند بوسیله چند سلول تمایز یافته برای مثال ،سلول های کامبیوم و سلول های نرده ای برگ ادامه دهد اما اینها که نمو به داخل ساختار ممتمایز یاخته پیدا نمی کنند. برای مثال:لوله های غربالی یا تراکئید ها بنظری ،سلول های گیاهان ،اندام ها یا گیاهان می تواند همه کلنی شوند و بصورت انبوه تولید بشوند که تمتم به صورت انفرادی تشکیل ژنتیک مشابه والدینی شوند. 1-17 آشنا شدن کشت های بافت گیاهی 1-17-1 جداکشت ها کشت بافت از قطعه از تمتم گیاه شروع نشده است. اندام های کوچک یا قطعه ای از بافت استفاده شده جداکشت نامیده می شوند.این بخش گیاه ( استوک گیاه یا مادر گیاه ) از جدا کشت بدست می آید. وابسته به: 1-نوع کشت آشنا شدن 2-مفهوم کشت پیشنهاد شده 3-قطعات گیاه استفاده شده جداکشت می تواند بنابراین تعداد انواع مختلفی داشته باشدانتخاب درست جداکشت می تواند اثرات مهمی در کشت بافت داشته باشد. گیاهان درمحیط بیرونی رشد می کنند بطورثابت با میکروارگانیسم ها و آفت آلوده می شود. این آلودگی محدود به سطح خارجی گیاه ،همچنین تعدادی میکروب ها و ویروس ها ممکن است سیستمیک با این بافت ها است. زیرا که آنها از جداکشت کوچک شروع می شود و محیط مغذی رشد می کنند.که همچنین مساعد برای رشد میکروارگانیسم ها است. کشت بافت گیاهی معمولا در شرایط ضد عفونی نگهداری و بر قرار می شود. بیشترین نوع میکروارگانیسم ها ،و در باکتری های بویژه و قارچی رقابت موتان های گیاهی در شرایط آزمایشگاهی رشد می کنند. جداکشت ها به طور آزاد از آلودگی میکروبی هنگامی که آنها در نخستین بار در یک محیط کشت قرار می گیرد. معمولا مستلزم رشد استوک گیاهان در مسیری که عفونت ... دارد،معالجه کردن ماده گیاهی با ضد عفونی شیمیایی به کشتن میکروب های سطحی و استریل کردن ابزار های برای استفاده از کالبد شکافی و ظرف ها و محیط کشت ها که رشد می کنند. تعدادی از انواع گیاهان می تواند در شرایط غیر استریل ریز ازدیاد شوند. 1-17-2 جداسازی و انکیباتور شدن کار جداسازی و انتقال به محیط کشت گیاهان معمولا در اتاق های مخصوص انجام می شود یا داخل هود ها از میکروارگانیسم ها می تواند خارج شوند. کشت ها ،در انکیباتور یا اطاقک رشد جایکه نور ،دما و رطوبت قابل کنترل باشد گذاشته می شود.سرعت رشد یک کشت وابسته به دما و گاهی اوقات نور دهی سازگاری پیدا می کند. 1-17-3 محیط کشت: کشت های گیاهان بوسیله جایگزینی یا یا بیشتر جدا کشت های به داخل محتوای دسترسی محیط کشت کشت شروع می شود. تعداد زیادی جداکشت ها رشد یا میمیرند.،در نتیجه آلودگی و میکروبی است:مراقبت شماری واسطه زنده ،معمول در آغاز چندین محیط کشت در زمان های مشابه است ،هر یک از یک اندام همانند از یک قطعه از بافت شروع می شوند. جداکشت ها از ... گیاهان در زمان های مختلف در سال گرفته می شود و ممکن است نتیجه قابل تولید در محیط کشت باشند. این ممکن است نتیجه تنوع در سطح آلودگی خارجی یا برای اینکه تغییرات فصولی در اندوژینوس و داخلی تنظیم کننده در سطح استوک گیاهان است. گیاهان فقط در شرایط آزمایشگاهی هنگامی که با محیط اختصاصی فراهم می شود،رشد می کند. یک محیط کشت معمولا شامل یک محول نمک ها از عنصر بزرگ و کوچک تشکیل شده لازم برای رشد گیاهان: -ویتامین های مختلف ( مجاز) - آمینو اسید های مختلف(مجاز) - یک منبع انرژی( معمولا سوکروز) تنظیم کننده گیاهی ترکیباتی هستند ،که در هر غلظت خیلی کم ،جفت کاهش دهنده رشد یا مرفولوژی گیاهی است. تعداد کارهای محیط کشت در ادغام نیتروژن در تنظیم کننده رشد تعریف شده است. محیط جامد محیط که یک ژل واسطه اضافه شده آنها ،برای اینکه نیمه جامد است.همچنین برای کشت کالوس یا اندام گیاهی ( شامل ریز ازدیادی) کاربرد دارد و برای دوره طولانی نگهداری کشت است. آگار بیشرین در جامد کردن است . 1-18ترکیبات محیط کشت بافت گیاهی: -مواد غذایی ماکرو و میکرو 1-ترکیبات متوسط آلی بافت گیاهی و اندام ها در شرایط آزمایشگاهی محیط رشد می کند،که تهیه مواد غذایی برای رشد کردن است موقیعت کشت بافت گیاهی یک معنی ازدیاد گیاهی تاثیر بگذارد بوسیله محیط کشت طبیعی استفاده شود. برای رشد سالم و قوی ،گیاهان لازم یه داشتن: نسبت مقدار بزرگتر تعداد عناصر آلی (تغذیه گیاهان اصلی نامیده می شود):یون نیتروژن،پتاسیم،کلسیم،فسفر،منگنزو سولفور است. کمیت کوچک از عناصر دیگر (مینور تغذیه گیاهی یا عناصر کم مصرف) آهن Fe ,Ni,Cl,Mn,Zn,B,Cu,Mo ثبت شده در Epstein ،یک عنصری می تواند به ضروری برای رشد گیاهان مورد رسیدگی قرار می گیرد اگر: یک گیاه پیر به کامل شدن چرخه زندگی بدون آن فعالیت ویژه و به طور کامل بوسیله هیچ عناصر دیگر نمی تواند جایگزین شود اثر مستقیم به ارگانیسم دارد .نه مسقیم به محیط تشخیص دهنده یک مولکول که به ضروری است. لیست عناصر ها،کربن ،اکسیژن و هیدروژن که هفت عنصر ضروری است.معین به کبالت،آلومنیم،سدیم ،ید هستند .ضروری یا سودمند برای تعداد گونه اما رایج ضرورت است. بیشترین عمومیت استفاده محیط از MS فرمول شکل می گیرد.این محیط برای رشد متعادل کالوس تنباکو و شمار زیادی خط منحنی پاسخ – دوز معدنی ضروری مختلف نمو پیدا می کند. جدول 1-1 نشان می دهد که ترکیب MS به ترکیبات اولیه نرمان مقایسه شده است که گیاهان رشد بیشتری دارند. در این جدول ،نسبتا کمترین سطح Ca,P,Mg در MS نشان داده شده است.بیشترین اختلافات که بالاترین سطح Cl وMo و کمترین سطح Cu به چشم می خورد. هر گونه گیاهی خصوصیت ترکیبات اولیه که می تواند به این محیط فرمول استفاده شود.این محیط نتیجه اغلب رشد را بهبود می دهد. یک شکل اصلی در نیترات ترکیبات معدنی در یک محیط رسوب است که اغلب ففط بعد از اوکلاو رخ می دهد زیرا فرایندپوشش درونی است. محیط کشت بافت گیاهی فقط از تغذیه آلی،اما معمولا یک کربوهیدرات سوکروز عمومیت دارد،تهیه شده است و به جایگزینی کربن در گیاهان از اتمسفر بوسیله فتوسنتز ثابت می شود. به بهبود کردن رشد ،تعدای محیط یعنی شامل اثر مقدار مقدار مشخص محتوای مواد آلی ،قابل ملاحضه ویتامین ،و تنظیم کننده رشد گیاهی است. در محیط ،ترکیبات عصاره مخمر و هیدرولیز و پروتین و ویتامین ها یا آمینو اسید های یا هر مکمل ها است. شیر نارگیل ،برای نمونه ،فراوانی استفاده می شود.هموژینت موز که عموما اضافه می شود به محیط برای کشت گیاه ثعلب است. محیط کشت بافت گیاهی همچنین ساخته شده است از محلول این ترکیبات: -عناصر ماکرو( همیشه کاربرد دارد) -مواد غذایی میکرو(نزدیک به همیشه کاربرد دارد اما گاهی فقط یک عنصر اهن استفاده شده است. - ماده رشد گیاه ( نزدیک به همیشه اضافه می شود) - ویتامین ( عموما ترکیب می شود .بنابراین شماری از ترکیبات اضافه می شود) آگار یا یک ژلان بیشترین انتخاب را دارد. امینو اسید ها و مکمل های نیتروژن ( معمولا حذف می کنند،اما گاهی اوقات نابجا است). نسبت نیترات آمونیوم برای پروسر های مختلف: رشد ریشه:رشد ریشه اغلب بوسیله NH4+سست می شود و بوسیله No3- بالا می رود. محیط برای کشت ریشه محتوای هیچ NH4+ یا خیلی کمتر نگه داشته می شود.بنابراین ریشه ها قادر به جذب یون های نیترات از محلول هستند که بطور پیش رونده بیشتر الکل که به فرایند تحلیل شده است که مشابه نمونه واقعی سلول های بافت ها واندام های در شرایط آزمایشگاهی است. کشت جوانه:محیطی فقط نیترات نیتروِن دارد برای کشت جوانه ها بیشتر گیاهان استفاده می شود ،برای مثال توت فرنگی ،که می تواند با(10.9mm)No3 کشت داده شود،و محیط با6mm)NH4) سبب فتوتوکسی است. لازم به عنصر یاشیب NH4ازمحیط برای کشت جوانه ها بهشیشه ای جلوگیری می کنند. 1-19تهیه ذخیره نیتروژن و مرفوژنز: مرفوژنز بوسیله کل مقدار نیتروژن در محیط تهیه می شود،یک ذخیره هر دو شیب نیتروژن و نیترات ضروری است. نیازمند برای مرکب از نیتروژن در یک گونه های گیاهی می تواند فقط بوسیله آزمایش کنترلی با دقت معین شود. به سادگی جزء ترکیب کننده نرمال محیط جداسازی می کند و یک تصویر می دهد. لپه های کاهو هنگامی NH4No3 حذف می شوند ،شروع به ریزش جوانه می کند. 1-20تعادل نیترات آمونیوم: بستگی به نسبت No3- وNH4+ در طول مرفوژنز مستقیم توضیح داده شده است و رشد گیاهان شرح داده شده است. بنابراین سلولی ابتدایی که منجر به باز تولید شدن گیاهان از کالوس جنین برنج است..کل نیتروژن در برنج 25تا45mm و No3- به NH4+ نسبت 50:50 به85:15 جدول 3-5اس جدول 1-2 مثال های از فواید و مضرات کل نیتروژن و NO3- و NH4+ در سطح پایین محیط شوری تمایز و رشد با نسبت کوچکی به نسبت No3- به NH4موثر است. نیترات آن 80:20 محیط (N6) به 75:20 ،در حدود 3 برابر افزایش در گیاهن آلی و رشد ریشه آورده شده ،جایکه کمتری آن 75:25در جوانه های کوچک با ریشه های ضخیم نتیجه داده شده است. رشد راسی ،از یک تعادل غیر مناسب نیترات وآمونیوم است،و دیگر گیاهان رویت شده است. جدول 1-3 مثال هایی از محتوای نیتروژن محیط MS ،که نتیجه بهبود رشد و مرفوژنز را دارد مرفوژنز بوسیله تمام نیتروژن دسترس نفوذ پیدا می کند.دیگر یافت شده محتوای تمام نیتروژن محیط کشت مورفوژنز ها پس از غلظت نسبی آمونیوم تاثیر دارد. افزایش نسبت جداکشت ها تشکیل جوانه روی محتوای کشت کوچکتر یا مقدار بیشتر ایجاد می کند.( مثال در محیط کشت MS ) 1-21جنین زایی و رشد جنین: در حال حاضر تعدادی نیتروژن تبدیل کردن لازمه برای جنین زایی سوماتیکی در سلول کشت بافت است،اما بنابراین تبدیل ترکیبات نیتروژن سودمند به ایجاد جنین سوماتیک ،ظاهرا ضروری نیست تا اینکه مرحله جنینی نمو پیدا کند. نسبتا سطح بالایی از هر دو نیترات و یون آمونیوم نیاز دارد.ازدیاد جنین زایی یا رشد جنین بهبود می شود که محیط با آمینواسید ای در اضافه به No3- وNH4+ اضافه می شود. سطح مساعدی NH4+ برای جنین زایی حدود 10-40mmNo3ازKNO3 که وجود دارد: ] نسبت NO3- به NH4+،از 55:45 به 80:20،کل 22-50mmنیتروژن است[ . هیچ جنین زایی در کالوس جو در غیر حضور یون های نیترات وآمونیوم است. محیط میلر (12.5mm NH4 ) نسبت بالایی ازجنین زایی است: ] نسبت NO3-بهNH4+،68:32،کل نیتروژن39.1mmاست[اما فقط یک شماری کوچکتر جنین های محیط (SH )تولید می شود: ] نسبت No3-بهNH4+،90:10،کل N27,32mm،با NH4+از آمونیوم کربومات تشکیل شده است[.کلرید آمونیوم یا آمونیات سولفات است.یک سطح متعادل آمونیوم در محیط 12.5mmSH است. ]نسبتNO3-بهNH4+،پس 66:34،کل N,37:22[،بنابراین جنین زایی در یک سطح بالا با 100mm یون آمونیوم است:] نسبت NO3- به NH4+،سپس 20:80،کل نیتروژن 124,72mm[. 1-22 جنین های زیگوتی : در حال حاضر تعدادی کاهش نیتروژن در محیط رشد برای رشد جنین های زیگوت در کشت لازم است.تنها نیترات کم است. تشکیل غنچه گل و رشد شان:نیترات ضروری برای تشکیل جوانه های نابجا است. در اضافه آمینواسید ها: آمینواسید ها می تواند در اضافه به محیط گیاهان به کمبود نیتروژن است اما آنها گران برای خرید است. فقط استفاده در محیط برای ازدیاد جایکه نتیجه بهبود دارد.برای بیشترین کشت بافت است ،دراضافهآمینواسید ممکن است غیر ضروری است. نسبت نیترات به آمونیوم: هنگامی که هر دوNo3- وNH4+ در محیط است،پاسخی به نیتروژن آلی بستگی به نسبت این دو یون است. آمینواسید های مثل منبع نیتروژن: بیشترین نیتروژن غیر آلی در محیط کشت ذخیره شده است که بوسیله بافت گیاهان به آمینواسید تبدیل می کند و سپس به درون پروتین ها جذب می شود. کشت گیاهان در محیط شان در اسید آمینه فقط منبع نیتروژن هستند.(George,2008)) 1-23اطلسی یک گیاه تزینی اقتصادی خوبی بشمار می رود.بزرگی تنوع و قابل موجود درردیف رنگ ها است.گیاهان زینتی منحصرا برای ارزش استاتیک تولید می شود.بهبود کیفیت نسبت هر یک رنگ و طول عمر ،شکل گیاهان ،تولید تنوع جدیدی مهمترین اهداف اقتصادی است. باز هم رشد و وابسته به پیشرفت تکنولوژی جدید ،مثل کشت بافت است.فاکتور های مختلف محیطی در شرایط آزمایشگاه ریخت زایی گیاه اطلسی است.(Abu-ouud,2011) Solanaceae 1-23-1 یک خانواده مهمی برای تزینات دارا می باشد،.اطلسی متعلق به زیر خانواده cestroideae Schitdl و قبیلهnicotianeae است. )cosade Gastiaora 1991 ;Hunziker 1979) ژن های با گونه های ریختی است.(.(Reis,2002 در جنوب آمریکا و باغچه های اطلسی ،زراعت بالایی هیبرید برای تزیین از بین petunia axillaris و p.intergrifolia است. شرحی برای اطلسی 3 شکل دانه مختلفی وجود دارد: 1-وسط لامیلا مواج و دیواره سلولی آنتی کلینال( تمام گونه های اطلسی) 2-نازک لامیلا مواج در دیواره سلول اونتی کلینال فرو رفته است،c.parviflora وc.pygmaea است 3-مستقیم وسط لامیلا و دیواره سلول آنتی کلینال تمام دیگر گونه های calibracha) است شکل 1-6 برای مثال:میکروگراف ناحیه میانی در p.intergrifolia.En:endodermis) ).(Reis,2002) به طور عمومی اطلسی ،از P.integrifolia مشتق می گیرد و P.axillari و 2تا از گونه های اطلسی دومی امریکا جنوبی هستند.شرح جغرافیایی شامل دما و ناحیه زیر خط استوا است. اطلسی برای باغچه شناخته شده است.یک گیاه تزیینی که جهان رویشی پیدا می کند.تعداد زیادی کولتیوار با یک رنج وسیعی از رنگ و اندازه و بذرها منبع مهم اقتصادی برای کشورها بشمار می آید. اطلسی یکساله یا گیاه بادوام ،که به 1m می تواند برسد،افراشته ،بالاروند،خوابیده،یا ساقه های خوابیده ،ریشه های واقعی در گرهک ها است. برگ ها بی سابقه هستند یا برگ دم دار هستند یا تیغه بیضوی ،تخم مرغی اند،خطی یا گرد هسند.جام گل قیفی شکل است،لوله گرده 1.5تا7سانتی متر طول داردوارغوانی،سفید،قرمز (روشن یا نارنجی)یاصورتی هستند(Renato Stehman,2009) شکل 1-7 گونه های های اطلسی در سال 1944 ،تابستان سختی که شماری از گیاهان در ایالات متحده امریکا از بین برد.اطلسی یک خبر ملی شد زیرا که به خشکسالی مقاوم است.تحمل در جمعیت های گسترش شده استقرار می یابد،که منجر به نمو کلتیوار جدید یا گل های رنگی است.اصلاح کردن کولتیوار در اطلسی آزمایش شده است. فقط 2 نوع اطلسی وجود دارد ( multiflora و grandiflora )است. انواع grandiflora تولید شماری کوچکی باز شدن در گیاهان با برگ های پهن است،مثل انواع برگ های multiflora تولید شماری گل های کوچکتر روی شاخه های گیاهان بزرگ با برگ های کوچک است.انواع multiflora،نوع های هیبریدا نامیده می شود.اولین نوع grandiflora در 1881 مثل یک تغییرات در چند شکلی ظاهر می شود(Defince strain ). 2-23-1تاکسونومی:اولین گونه بوسیله P.commersonدراورگوئه جمع آوری شده است اما بوسیله lammarckj. در سال 1793مثلNicotiana axillavi شرح داده شده است. A.dejussion در سال 1803 ژن های اطلسی انجام داده است و جمع آوری تاکسون بوسیله کامرسون در آژانتین petunia …aginifora شرح داده شده است.اسم اطلسی از اصطلاحات بومی برای تنباکو ،petun مشتق گرفته شده است. L.parodi دیگر تاکسون به P.axillaris در آژانتین وابسته به هم است.(Griesbach,2007) 1-23-3آناتومی نشا اطلسی: اطلسی ،یک طبیعت جنوب آمریکا زمان 1823 ،در این زمان به کل جهان توزیع شده است.زیرا یک گیاه ارزشمند و تزینی بشمار می رود.در طی قرن اخیر در سیتولوژی و ژنتیک ژن ها منتشر شده است و در دانشگاه wallesky انجام داده شده است.(Grant,1934) والسکی ،ماساچوست ئر سال 1803 فردی بنام A.L.jussienژن های اطلسی را کشف کرد و در هرباریوم کامررسون نگهداری می شود.این گیاهان petunia nyctayin flora و P.povviflora نامگذاری شده است. یکی از ان گونه ها p.nyctagin که در زیر بنام Nicotiana axillaris بوسیله لامارک در 1793 شرح داده شده است.نمونه لامارک بوسیله کامرسون جمع آوری شده است (Grant,1934) دیگر تغییرات گل دهی بزرگ (superbissima) در 1888 مشاهده شده است. 1-23-4تولید اقتصادی:ریزازدیادی اقتصادی ابتدا با دانه است،بنابراین در سالهای اخیر،کلیواز زیاد کرده است.این گونه ها و کلیواژها،نور برای جوانه زدن لازم است. 1-23-5فرایند جوانه زذن را به 4 مرحله نقسیم می شود: در طول مرحله 1:از دانه پدیدار می شود.لپه ها در طی مرحله 2 و اولین برگ ها در طی مرحله 3 پدیدار می شود. در طی مرحله 4،جوانه ها به مقدار زیاد رشد می کند. برای اطلسی،شرایط متوسط برای هر مرحله رشد اندازه گرفته می شود(جدول 1-4) جدول 1-4 شرایط کشت بافت برای جوانه زدن دانه ها و رشد اطلسی هیبریدا نشا ها معمولا در خاک با PH بین 5.8 و6.5 و انتقال الکتریکی بین 0.75 و1.25 است.گیاهان رشد کرده با 20-10-20 یا یک تعدل کود در 30-200ppm نیتروژن حاصلخیز می شود. 1-23-6پاسخ گیاهان اطلسی به روشنی روز 2 مسیر می شود: روز بلند تسریع در گل دهی است و رشد طویل با چندین شاخه جانبی است که در روز کوتاه گل دهی عادت می کند و تولید یک رشد روزت را دارد. اثرات مختلف سطوحNAAوBAتولیداطلسی هیبریدی مطلالعه شده است.تولید جوانه ها از جداکشت های برگ رشد در شرایط آزمایشگاهی برای آنالیز تنوع سوماکولونا است.جوانه های اطلسی هیبریدی در شرایط آزمایشگاهی درروی محیط MSمطالعه شده است. برای آزمایشات جوانه ها ،جداکشت های جوانه از نشاها تولید می شوند.در محیط MS با BA,NAA در غلظت های 0.1,0.6,0.8 mg1- بوجود می آید.بنابراین شمارش جوانه های در محیط با BA 0.8mg1- وNAA 0.1 mg1-است.(Sunoui,2002) 1-24 نقش های اکسپانسین در نمو اطلسی : اکپانسین ها ها،یک مشتق شده از پروتین های یافت شده در گیاهان و یک نقش تخصصی در یک سلول گیاهی بازی می کند.در نتیجه انجام قشری در مرفوژنز گیاهان دارد،نمو و در شرایط استرش سازگار پیدا می کند.شماری از ژن های اکسپانسین از اطلسی جمع آوری کره اند. تهیه آنالیز گواهی برای وظایف دیواره سلولی را شامل می شود،شامل متابولیسم سلولز ،جدا شدن ماتریکس دیواره سلول در حال اکسپانسین سلولی است.(Zenoni,2009) سیستم جوانه زنی گل دهی گیاهان جمع آوری شده از اجزاء ترکیب شونده که از مریستم راسی جوانه ها مشتق شده است. حدود رویشی گل دهی گیاهان شامل ین گرهی ،یک گره برگ جوانه جانبی در ابتدا برگ است. که شمارش مریستم راسی جوانه افزایش می یابد.هنگامی که جوانه جانبی به شاخه آخری نمو پیدا می کند. در بیشترین گل دهی گونه های گیاهی ،پیشرفت جوانه جانبی تاخیری است،نسب به نمو برگ اصلی است و نخستین در ابتداجذب می شود و دومی و سومی برگ متعلق راسی است. بنابراین جوانه خارج از مجاورت مریستم راسی و نوک جوانه می تواند رشد جوانه های کنترل می کند و نمو در تعداد گونه های گیاهی باشد. اطلسی یک محصول گلخانه ای و ارزش صادرات دارد. مطالعه شناسایی استمرار و نشانه موتاسیون فیزیولوژی برای حاصل کشت دانه ها که ضروری نسبت به شکوفایی باز شده است. نتیجه آشکاار می کند که دانه فیزیولوژی در25DAAکه با فیزیکی نزدیک به ماکزیمم وزن مرطوب و خشک نیام و دانه و وزن نیام غلاف به رنگ قهوه ای و دانه به قهوه ای تیره است. محتوای رطوبت دانه در زمان کامل شدن 26.5 پیر سینت که وزن خشک 2mg که دانه به طی 20 روز جوانه می زند و ماکزیمم 96 جفت با کامل شدن فیزیولوژی (25DAA) مطبق می شوند.پرداخت با تاخیر نیام بعداز2تا3 روزکامل شدن فیزیولوژی منجر به 100 جفت خرد شود. دانه یکی از پدیده های شگفت انگیز است.گلکاری سریع ناشی می شود در صنعت جهانی است. تولیدات گیاهان زینتی و صنعتی مورد رسیدگی باغبانان می شود و جنبه اقتصادی دارند.گل ها و باغ ها خیلی اجتکاعات نزدیکی در کشت در زمانها ،مثل گل ها شاخص زیبایی هستند ،عشق و آسایش در زمان های خیلی قدیمی و از باغچه شخصی به انتقال دادن پیام طبیعت است. صرف نظر تراکم اقتصادی وجود دارد بزرگترین اصلی به نمو تولیدات گلکاری یک صنعت است.اطلسی یک محصول با ارزشی است. وضع محصولات مختلف که در مدت و نشانه دانه در طول رشد و نمو مجوزی برای هر محصول که خیلی از محصول به محصول است اما دانه به دانه است.از این رو مطالعه ساخت به نشاندر مدت ونمو تغییرات در طی کامل شدن در petunia cv.mix از میان فیزیکی و فیزیولوژی و نشانه واقعی است.(Natarajan,2008) 1-25اثرات آلودگی محیطی حاصل از ترافیک جاده ای بر برگ های اطلسی اثرات آلودگی محیطی حاصل از ترافیک جاده ای اثر عناصر و شستشو و غیر شستشو برگ های اطلسی آزمایش شده است.گیاهان در شهر وحومه ها رشد می کنند. مقدار واقعی عناصر بوسیله شستشو با آب دیمره شده است،انتقال می یابد که سرانجام 45%AL,Fe,Pb و 15%Mn,Cu,Zn در محیط های شهری انتقال می یابد.جایکه محیط از این مکان ها گرفته شده است.غلظت های Fe,Cu,Al,NiوPbدراثرشستشو برگ های گیاهان اطلسی در شهری رشد کرده اند ،افزایش می یابد.این گیاهان بطور خصوصی محتوای Mn وZnراکنترل می کنند. غلظت عناصر شستشو برگ های از محیط شهری بیشتر از محیط های حومه شهری است.گیاهان زینتی که قادر به جذب Fe,Ni,Pb از ریشه و برگ دلالت می کند.ارزیابی دوره ای ،تراکم اثر عناصر در محیط های شهری با ترافیک زیاد ارزیابی نسبت آلودگی محیط ای است.آلودگی محیط بوسیله ماده های سنگی و شبه فلز ممکن است از طریق انتشار ومنبع مثل صنعت ،ترافیک،خانگی،انرژی ذخیره ای و کشاورزی رخ می دهد.(Caselles,2001) 1-26تکنیک های کشت بافت گیاهی : تکنیک های کشت بافت گیاهی ضروری به تعدادی نمونه های تحقیقات آکادامیک است،تعدادی جنبه کاربردی علم گیاهی است.در گذشته ،تکنیک های کشت یافت گیاهی در رسیدگی توتی پتانسی و تنش های هورمون ها متمایز شده و ارگانژنز شده است.کشت بافت گیاهی همچنین اصلی به مناطق نوآوری علم کاربردی گیاهی ،شمال بیوتکنولوژی گیاهی و کشاورزی است.برای مثال،انتخاب گیاهان می تواند به کلنی کردن و کشت سوسپانسیون سلول ها است که تولید گیاهان می تواند قابل برداشت باشد. در اضافه ،نظارت مهندس ژنتیک سلول به رنس ژن است،که گیاهان نیاز به تولید کشت بافت دارند،روش های کشت بافت در تشکیل به جنس های هاپلوئید سوماتیکی نیاز دارند که گیاهان هموزیگوت را تولید می کنند.تکنیک های کشت بافت برجسته ای بر آکادامیک و علم کاربردی گیاهی است. 1-26-1 اصلاحات کشت بافت : Aseptic :ضد عفونی :پاکسازی از میکروارگانیسم ها Callus plant hormone level :سطح های هورمون کالوس گیاهی :غیر متمایز،سلول متورم و تشکیل تحت نفوذ ترفیع می شود. Etiolation:زرد و قسمت های کشیده شده که با روشن جدا شده است. Explant:جدا کشت :قسمتی از یک اندام که در شرایط آزمایشگاهی کشت می شود. IAA:یک هورمون گیاهی در افزیش طول سلول ها و تحت موقیت معین ،در محرک تقسیم سلول و تشکیلات ریشه است.حرکت اکسین IAA در تشکیل گیاهان در شیب اکسین IAA در بافت است.تعیین موقعیت اندام های گیاهان ،نفوذ تشکیات کالوس و مرفوژنز است. Invitro:روش های کشت بافت در شرایط کشت بافت Morphoy genetic:تغییرات در شکل Polarity:قطبیت:تعیین موقیعت در جاذبه زمین Primordia:مرحله واضحی در اندام ها ،که برگ ریشه و انشعابات ریشه ها تار کشنده ریشه ها:سلول های اپیدرم ریشه های جوان که افزایش جذب سطح محیط است. Totipotency :استقرار قسمت های یا اندام های گیاهان:تشکیلات گیاهان از چند سلول یا قسمت های کوچکتر است. Wound response :جراحت:تشکیلات کالوس در محل جراحت Grant,1934)) 1-27 اثرات تعادل هورمون در مورفوژنز و رشد جدا کشت ها: هورمون های گیاهی ،شبیه هورمونهای جانوران،مولکولهای نسبتا کوچکی هستند که اثراتی در غلظت بافت دارد. 2 تا نمونه ها هورمون های گیاهان در آزمایشات استفاده شده سیتوکنین و آیوکسین هستند.سیتوکنین از آدنین مشتق شده است و تولید2اثر فوری در سلول های غیر متمایز را دارد:تحریک DNA سنتتاز و افزایش تقسیم سلولی است. سیتوکنین همچنین تولید شده یک پاسخ تاثیری در بافت غیر متمایز است که تشکیلات جوانه نخستیت است. هر دو طبیعتا در سیتوکنین رخ می دهد،مثل zeatin و آنولوگ سنتز می کند.مثل کتین،اثرات سیتوکنین شرح داده شده است.(شکل 9-3( شکل 1-8 فرمول ساختاری هورمون های تمایز و رشد گیاهی بنابراین ،بافت کمترین غلظت سیتوکنین(1×10 -8) اثرات قابل ملاحضه ای دارند،بالاترین غلظت در فعالیت تقسیم بافتی شده است. ایوکسین ترکیبات اندول یا شبه اندولی دارد تهیه تحریک افزایش سلول ،امتداد سلول است. ایندول استیک اسید (IAA) ،طبیعتا اکسین رخ می دهد و NAA،یک سنتز اکسین ،9-3شرح داده شده است. فقط مقداری کوچک آیوکسین (1×10-6M) به شرح پاسخی IAAشرح داده شده است و کوچکترین مقدار سنتز آیوکسین (NAA) برای پاسخ بافتی نیاز دارد.شبه پاسخی برای توانایی سنتز آیوکسین استحکام در بافت گیاهان است.(آنزیم ها و فرایند های که اکسین شناسایی نشده سنتز آیوکسین است.) ستز آیوکسین ،سپس بیشتر اثرات هورمون هایی که هکچنین برای در طول زمان توسعه می یابد.به علاوه ،نفوذ نور که فعالیت فیزیولوژی اکسین IAA که سنتز آیوکسین حساسیت نوری ندارد. هر تقسیم سلول و افزایش در فعالیت تقسیم بافت رخ می دهد،میزان سیتوکنین و آیوکسین نقش در رشد بافت گیاهی بازی می کند.( Grant,1934) نیتروژن نقش اصلی در رشد و تمایز هر یک از ساقه طویل و مرفولوژی برگ را بازی می کند.شکل و میزان نیتروژن در شرایط آزمایشگاهی محیط کشت پر معنی در سرعت رشد سلول و تمایز یابی است. محیط های murashige and skook (MS) استفاده شده در محیط های پایه تمامی یا نصف نیتروژن MS است،فقط نیترات (KNO3) و نیترات آمونیاک NH4No3 یا بدون تکثیر بوسیله گلوتامات (100mgL-1)است. (Zenoni,2009) تمام قدرت MS فعالیت تولید کالوس ها جلوگیری می کند که می تواند کمترین میزان آمونیوم یا کل نیتروژن باشد. محیط کشت یا نصف محیط MS نیتروژن بهتر تحریک تولید کالوس می کند که می تواند بوسیله گلوتامات افزایش یابد.نیتروژن الحاق کردن نیترات هیچ کالوس تولید نمی شوداما جوانه های جانبی از کالوس و مثل برگ های لامینا تشکیل می شود.حدس زده می شود نیترات می تواند جوانه های جانبی از نوک رها شوند..در کشت بافت اگر ریز ازدیادی گیاهان است،جوانه های می تواند زمان کوتاهتر بوسیله حذف نمک آمونیوم از محیط است. نیتروژن و نقش آن در رشد گیاهان و نمو در فهمیدن تمایز سلول در گیاهان است. هر دو شکل و مقدار نیتروژن در محیط کشت در شرایط آزمایشگاهی اثرات معنی دار در سرعت معنی دار در سرعت رشد سلول ،تمایز و قدرت بارزایی است. (Zenoni,2009) در محیط کشت بافت نیترات ،نمک آمونیوم ،آمینواسید های و ارگنیک پیچیده تولید نیتروژن دار می شود.نیترات منبع خوبی از نیتروژن است زیرا به آسانی جذب می شود و بوسیله سلول نمو متابولیزه می شود و اثرات فرایند نمو مهمی به انشعاب ریشه ها،شکستن دانه و غنچه ها و آزاد شدن قلمرو راسی است. محیط کشت با نیترات مثل فقط منبع نیتروژن دارد ،زیرا بیشترین الکل در این زمان،یک تمایل که می تواند بوسیله اضافه کردن مقداری نمک آمونیوم کنترل شوند. کنترل PH فقط دلیل برای استفاده هر دو نیترات و آمونیوم در محیط کشت است،اما تعادل آمونیوم نیترات ریخت زایی و جنین زایی را تحریک می کند.بنابراین دقت کنید آمونیوم سمی است. اسپانسین پروتین های یافت شده در گیاهان و تعدای دیگر موجودات زنده ،یک نقش تنظیمی در اکپانسین سلول را بازی می کنمد ،وسیله عملکردهای های در ریخت زایی ،نمو و ظاهری در استرس ها گیاهان است.ریخت زایی در نمو به تشکیل شکل و ساختار بافت است. (Zenoni,2009) در جانوران ،تشکیلات ساختار بافت مربوط به به هم کنش سلول – سلول است. مخصوصا سود و از دست چسبندگی سلول است.این اجازه می دهد به سلول نسبت به طرف دیگر حرکت می کند یا تقسیم سلول ها است.در مقابل ،دیوار های سلول گیاهان سخت ،و سلول های سخت و سلول ها چسبیده به هم که در مکانیسم در گیاهان در گیاهان استفاده می شود.از این قبیل موقیعت ،سرعت،گیاهک،و تناسب تقسیم سلول و تقسیم کننده اکسپانسین سلول است.(Zenoni,200 1-28پیش برنده های(Promotera) ژن و مناطق کنترل: در DNAی بالا دست (Upstream) هر یک از ژن های رمز دار کننده پروتئین های ویژه اندام ها،توالی های پیش برنده ای وجود دارند که به نظر می رسد برای بیان ژن ها ضروری هستند.این موضوع با انتقال ژن ها،با استفاده از حمل کننده های پلاسمیدی از گیاه دهنده(Donor) به گیاه پذیرنده (Receptor) یا گیاه ترانس ژنیک(Transgenic) نشان داده شده است. DNA پروتین های دانه لوبیای روغنی به گل اطلسی ،ترانس ژنیک انتقال یافته است.هنگامی که رونوشت DNA قبل از انتقال ،در ناحیه _69 تا _159 بالا دست ژن حذف شود،این ژن در گل اطلسی بیان نمی گردد،اما زمانی که این بخش از DNA وجود داشته باشد ژن پروتئین لوبیای روغنی در دانه های گل اطلسی بیان می شود.این آزمایش نشان می دهد که : (1)توالی مشابه تنظیمی در گونه های مختلف شناسایی شده است،یعنی به احتمال توالی عمومی حفظ شده تنظیمی وجود دارد و این توالی برای بیان ژن ضروری است. (2)بیان ویژه ژنهای هر اندام در بین گونه ها حفظ شده است.بنابراین،ناحیه تنظیمی منطبق با نوع اندامی است که ژن در آن یافت شده است. فعال شدن ژن ها در نور نیز دلیلی بر وجود توالی بالادست تنظیمی است که در کل گیاهان بازشناسی شده است،ژن هایی که با نور فعال می شوند نیاز خود را در صورت انتقال از گونه ای به گونه دیگر حفظ می کنند. ژن کد کننده زیر واحد کوچک پروتئین روبیسکو(Rubisco) که از نخود به دست آمده است در گل اطلسی ترانس ژنیک در نور بیان می شود.بیان ژن ها علاوه بر ویژه شدن (Specificity) اندامی ،ویژه شدن یاخته ای و بافتی نیز دارد.(عبادی,1375 ( دریافت فایل غلظت های گوناگون NH4No3 و KNO3 بر روند کشت بافت گل اطلسی Petunia hybrida L.

راهنمای اجرا و تفسیر آزمون اندریافت کودکان CAT + به همراه تصاویر

راهنمای اجرا و تفسیر آزمون اندریافت کودکان CAT + به همراه تصاویر آزمون اندریافت کودکان، یک آزمون فرافکنی است که برای سنجش شخصیت کودکان ۳ الی ۱۰ ساله به‌کار می‌رود. این آزمون با اقتباس از آزمون اندریافت بزرگسالان(TAT) توسط لئوپولدبلاک و سونیا بلاک در آمریکا در سال ۱۹۴۹ ساخته شد. مواد این آزمون شامل ۱۰ کارت است که روی هر یک، تصویرهایی از حیوانات مختلف در حالت‌های رفتاری شبیه به رفتار‌های انسان ترسیم شده است. علت انتخاب حیوانات به عنوان محرک دیداری فرافکن، مصاحبه‌ای بوده است که بلاک‌ها با ارنست کریز داشته‌اند. کریز، معتقد بوده است که کودکان با حیوانات بهتر از انسان‌ها فرافکنی می‌کنند. تعداد صفحات: 13 صفحه ورد و 10 تصویر شامل: نحوه اجرا و تفسیر آزمون + تصاویر آزمون نوع فایل: WORD  دریافت فایل راهنمای اجرا و تفسیر آزمون اندریافت کودکان CAT + به همراه تصاویر

طراحی، انالیز بیوانفورماتیکی، همسانه سازی و بیان مولتی توپ انتی ژن اختصاصی کارسینومای سلول های سنگفرشی مری

طراحی، انالیز بیوانفورماتیکی، همسانه سازی و بیان مولتی توپ انتی ژن اختصاصی کارسینومای سلول های سنگفرشی مری چکیده سرطان مری به عنوان ششمین سرطان شایع و عامل مرگ و میر بر اثر سرطان در بین افراد می باشد. با وجود روش های درمانی موجود مانند جراحی، رادیوتراپی و شیمی درمانی، میزان بقاء پنج ساله بیماران در حدود %10 تا %13 می باشد. فقدان علایم زودرس اولیه موجب می شود که در زمان تشخیص، بیماری در مراحل پیشرفته باشد. کارسینوم سلول های سنگفرشی مری یکی از دو نوع سرطان مری است که بیشتر در مردان و افراد بالای 50 سال سن دیده می شود. بیان مولکول چسبندگی سلول های اپی تلیالی یا EpCAM در انواع سرطان های گوارش به خصوص سرطان مری افزایش می یابد. هم چنین در مراحل مختلف سرطانی شدن، با پیشرفت بیماری، بیان ان بیشتر می شود. از این جهت می توان از ان به عنوان مارکری مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما بر ان شدیم که با استفاده از دو اپی توپ ایمیونوژن پروتئین EpCAM و اتصال انها به کمک لینکری مناسب، یک مولتی توپ کایمریک ایمیونوژن ایجاد و زمینه را برای استفاده از ان جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیصی سرطان مری فراهم کنیم.روش کار;در این مطالعه ابتدا اپی توپ های مورد نظر به کمک بانک های اطلاعاتی ژنی انتخاب شدند. سازه ی نو ترکیب طراحی شد. سپس با انالیز های بیو انفورماتیکی و کامپیوتری، خواص مهم مثل پایداری، انرژی، فولدینگ مناسب، ایمنی زایی و ... ، که در سنتز این مولتی توپ مهم هستند را مورد بررسی قرار دادیم. ژن طراحی شده به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال داده و تکثیر کردیم. در انتها نیز بیان مولتی توپ کایمریک طراحی شده را در باکتری های نو ترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار دادیم.بحث و نتیجه گیری:مولتی توپ کایمر طراحی شده دارای پایداری و انرژی مناسبی بوده و می تواند به مانند اپی توپ های پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده وباکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین کایمریک مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان مری به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود. واژه های کلیدی: سرطان مری، EpCAM، مولتی توپ کایمر، کلونینگ فهرست مطالب عنوان صفحه چکیده فارسی  1 فصل اول: مقدمه 1-1 سرطان مری  3 1-1-1 تعیین مرحله بیماری  4 1-1-2 عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان مری  5 1-1-3 تغییرات مولکولی در سرطان مری  5 1-1-3-1 تغییرات مولکولی در EAC  5 1-1-3-2 تغییرات مولکولی در EACC  6 1-1-4 درمان های رایج سرطان مری  6 1-1-4-1 جراحی  7 1-1-4-2 رادیوتراپی  7 1-1-4-3 شیمی درمانی  8 1-1-4-4 لیزر درمانی  8 1-1-4-5 فتودینامیک  8 1-2 پروتئین EpCAM  9 1-3 مسأله ی تحقیق  12 فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده 2-1 EpCAMدر درمان سرطان  13 فصل سوم: مواد و روش ها 3-1 مواد مورد استفاده  17 3-1-1 باکتری مورد استفاده  17 3-1-2 پلاسمید  17 3-1-3 انزیم ها  17 3-1-4 کیت های ازمایشگاهی  18 3-1-5 انتی بیوتیک ها  18 3-1-6 محیط کشت باکتری  18 3-1-7 ژل الکتروفورز  18 3-1-8 مواد شیمیایی  18 3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی  18 3-2 طراحی و انالیز بیوانفورماتیکی مولتی توپ پروتئین EpCAM 22 3-2-1 طراحی مولتی توپ کایمر  22 3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization  23 3-2-3 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های سلول های B 23 3-2-4 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های سلول های T 23 3-2-5 پیش بینی میزان تمایل اتصال اپی توپ ها به MHC 24 3-2-6 پیش بینی ساختار دوم mRNA  24 3-2-7 پیش بینی ساختار دوم پروتئین  24 3-2-8 شناسایی نواحی تداخل کننده  24 3-2-9 تعیین ساختار سوم پروتئین  24 3-2-10 تعیین میزان انتی ژنیک بودن و محلول بودن پروتئین 24 3-2-11 تعیین میزان پایداری پروتئین  25 3-3 سنتز شیمیایی DNAکایمر طراحی شده  25 3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب  25 3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNAسنتز شده  25 3-3-3 محلول سازی DNAلیوفیلیزه  25 3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSK حاوی DNAمولتی توپ EpCAM 25 3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته  26 3-4-1-1 مواد و محلول ها  26 3-4-1-2 روش کار  26 3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli 27 3-4-2-1 روش کار  27 3-4-3 ارزیابی کلونی ها  27 3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+pBSK حاوی DNAمولتی توپ EpCAM 28 3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده  30 3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion  30 3-4-5-2 الکتروفورز  30 3-5 ساب کلونینگ ژن مولتی توپ EpCAM  32 3-5-1 تخلیص DNAمولتی توپ EpCAMاز ژل  32 3-5-2 لایگیشن  33 3-5-3 ترانسفورماسیون  34 3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته.................................................................................................................................................................................................................................................................................... 34 3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3)با محصول لایگیشن.................................................................. 35 3-5-4 ارزیابی کلونی ها............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن مولتی توپ EpCAM..................................................................................................................................... 35 3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده........................................................................................................................................................................................................................................................................... 37 3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM........................................................................................................................................................................................................................................................................................ 38 3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG..................................................................................................................................................................................................................................................................................... 38 3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page...................................................................................................................................................................................................................................................... 38 3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها.......................................................................................................................................................................................................................................................................... 39 3-6-2-2 Run کردن نمونه ها................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 40 3-6-2-3 رنگ امیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی........................................................................................................................................................................................................................................... 40 فصل چهارم: نتایج 4-1 نتایج حاصل از طراحی و انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین EpCAM....................................................................................................................................................... 42 4-1-1 مولتی توپ کایمر طراحی شده................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 42 4-1-2 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization..................................................................................................................................................................................................... 42 4-1-3 انالیز ساختار mRNA.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 46 4-1-4 ساختار دوم پروتئین............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 47 4-1-5 پیش بینی ایمیوژنیک اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیتB...............................................................48 4-1-6 پیش بینی اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T............................................................................................................. 50 4-1-7 پیش بینی تمایل اتصال پپتید ها به مولکول MHC............................................................................................................................................................................................................. 50 4-1-8 شناسایی نواحی تداخل کننده........................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 51 4-1-9 پیش بینی ساختار سوم پروتئین............................................................................................................................................................................................................................................................................................... 51 4-1-10 نتایج حاصل از تعیین میزان آنتی ژنیک بودن و محلول بودن پروتئین...................................................................................................................... 52 4-1-11 بررسی پایداری پروتئین نوترکیب.............................................................................................................................................................................................................................................................................. 53 4-2 سنتز شیمیایی DNAکایمر طراحی شده نو ترکیب........................................................................................................................................................................................................................ 54 4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSK حاوی DNAمولتی توپ EpCAM........................................................................................................................... 56 4-4 ساب کلونینگ ژن مولتی توپ EpCAM.................................................................................................................................................................................................................................................................. 58 4-5 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page.............................................................................................................. 61 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری بحث............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 63 نتیجه گیری........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 72 منابع....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 73 چکیده انگلیسی...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 7 فهرست شکل ها عنوان صفحه شکل1-1. میزان مرگ و میر ناشی از سرطان مری در سال 2004 4 شکل1-2.بیان مختلف پروتئین EpCAMدر سلول نرمال و مراحل مختلف سرطانی شدن سلول سنگفرشی مری....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 10 شکل 1-3. ساختار پروتئین EpCAMو اپی توپ های شناسایی شونده توسط انتی بادی های اختصاصی ان.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 11 شکل 3-1. انکوباتور ممرت................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 19 شکل 3-2. شیکر انکوباتور ان بی اس..................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 19 شکل 3-3. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ.................................................................................................................................................................................................................................................. 20 شکل 3-4. سانتریفیوژ اپندورف المان...................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 20 شکل 3-5. بن ماری ممرت.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 21 شکل 3-6. ترموسایکلر پرکین المر.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 21 شکل 3-7. دستگاه تصویرساز ژل سینژن......................................................................................................................................................................................................................................................................................... 22 شکل3-8. کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز.................................................................................................................................................................................................................................................................................... 28 شکل 3-9. کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز........................................................................................................................................................................................................................................................ 32 شکل 4-1. نمای شماتیک مولتی توپ طراحی شده.......................................................................................................................................................................................................................................... 42 شکل 4-2. شاخص سازگاری کدون......................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 43 شکل 4-3. میزان فراوانی کدون های بهینه.................................................................................................................................................................................................................................................................................. 44 شکل 4-4 شاخص محتوای G-C........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 45 شکل 4-5. ترادف مولتی توپ ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 45 شکل 4-6. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده................................................................. 46 شکل 4-7. ساختار دوم mRNA پیش بینی شده بعد از بهینه سازی..................................................................................................................................................................... 47 شکل 4-8. پیش بینی ساختار دوم پروتئین.............................................................................................................................................................................................................................................................................. 48 شکل 4-9. اپی توپ های خطی ساختار مولتی توپ پروتئینیبرای لنفوسیت B......................................................................................................... 49 شکل 4-10. اپی توپ های غیر خطی ساختار مولتی توپ پروتئینی برای لنفوسیت B............................................................................... 49 شکل 4-11 . اپی توپ های شناسایی شونده توسط سلول های لنفوسیت T در ساختار مولتی توپ نوترکیب با استفاده از پایگاه CTLpred............................................................................................................................................................................................................................................................................................... 50 شکل 4-12. پیش بینی تمایل اتصال پپتید ها به مولکول MHC...................................................................................................................................................................................... 51 شکل 4-13 پیش بینی نواحی تداخل کننده در ساختار پروتئین......................................................................................................................................................................................... 51 شکل 4-14. ساختار سوم پروتئین...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 52 شکل 4-15. میزان در دسترس بودن اسید های امینه پروتئین نوترکیب برای حلال..................................................................................................... 53 شکل 4-16. نمودار راماچاندران اسید امینه های پروتئین نوترکیب.............................................................................................................................................................................54 شکل 4-17. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی................................................................................................................................................................................................ 55 شکل 4-18. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAنوترکیب مولتی توپ EpCAM....................................................................................................... 56 شکل 4-19. تائید حضور پلاسمید حاوی ژن مولتی توپ EpCAMدر محصول استخراج پلاسمید......................... 57 شکل 4-20. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK............................................................................................................................................................................................. 58 شکل 4-21. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a.............................................................................................................................................................................................................................................................................. 59 شکل 4-22. باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن مولتی توپ................................................. 60 شکل 4-23. تائید حضور پلاسمید pet-28a حاوی ژن مولتی توپ EpCAMدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 60 شکل 4-24.نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28a حاوی ژن مولتی توپ EpCAM............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 61 شکل 4-25. بررسی بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM به کمک تکنیک SDS-page...................................................................................... 6 فصل اول: مقدمه 1-1 سرطان مری سرطان مری[1]با نزدیک به 000/400 مورد منجر به مرگ در سال، ششمین عامل مرگ ومیر ناشی از سرطان در جهان است. میزان مرگ ومیر ناشی از سرطان مری در سال، از حدود 3 در105 نفر در سفید پوستان ایالات متحده آمریکا تا بیش از 100 در 105 نفردر برخی از نواحی کشور چین متغیر است. این سرطان به انواع گوناگونی تقسیم میشود که دو نوع کارسینوم سلول های سنگفرشی مری[2](ESCC) و آدنوکارسینوم مری[3](EAC) آن بسیار رایج است. (کمانگر و همکاران، 2007) اگر چه عامل های خطر و اپیدمیولوژی ESCC و EACبا هم متفاوت اند ، اما پیش آگاهی هر دو بسیار ضعیف است به نحوی که بقای پنج ساله بیماران ، 10 تا 13 درصد گزارش شده است. (سمپلینر و همکاران، 2009)[4] در مورد تاریخچه ی بیماری، تا سال 1970 بیش از 90% سرطان مری از نوع سنگفرشی و نوع ادنوکارسینومایی تقریبا نادر بوده و از این زمان به بعد نوع ادنوکارسینومایی رشد یکنواختی را شاهد بوده است. مطالعات ایپدمیولوژی گسترده ای در کشورهای مختلف در زمینه عامل های خطر، بروز وشیوع انجام گرفته است . در مطالعات انجام گرفته در زمینه ی بروز EAC در ایالات متحده آمریکا ، مشخص شده است که در سال 2000 سرعت افزایش بروز آن نسبت به سایر سرطان ها پیشی گرفته است و رشدی بین 3 تا 5 برابر در نژادهای مختلف در فاصله ی زمانی بین سال های 1975 تا 2004 گزارش شده است. (دمیستر، 2009)[5] در سال 2009 در ایالات متحده آمریکا ، EAC دو سوم موارد سرطان مری را به خود اختصاص داده است. (ژو، 2009)[6]این درحالی است که در کشورهای شرق آسیا و آسیای مرکزی از جمله ایران ، ESCC رایج تر است. (دمیستر، 2009) مطالعات انجام شده در ایران نشان دهنده میزان بالای خطر ابتلا به سرطان مری در نواحی ساحلی دریای خزر بویژه در استان گلستان است. (کمانگر و همکاران، 2007) هم چنین مطالعات سال 2008 که در استان کرمان انجام گرفته است بیان گر افزایش 11 درصدی خطر ابتلا به EAC در سال است ، در حالی که خطر ابتلا به ESCC کم و بیش ثابت بوده است. (حق دوست و همکاران، 2008) در شکل 1-1، براورد حاصل از میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از سرطان مری در جهان در سال 2004، نشان داده شده است. شکل1-1.میزان مرگ و میر ناشی از سرطان مری در سال 2004. داده ها در مقیاس هر 100.000 نفر محاسبه شده اند. (سازمان بهداشت جهانی، 2009)[7] 1-1-1 تعیین مرحله بیماری تشخیص مرحله بیماری یکی از مهم ترین مواردی است که در چگونگی درمان و وضعیت بالینی تاثیر دارد. تعیین مرحله ی بیماری، کوششی دقیق جهت اطلاع از توسعه و پیشرفت سرطان و این که سرطان به چه قسمت هایی از بدن بیمار پیشرفت کرده است، می باشد. هم چنین به پزشک کمک می کند تا برنامه ی درمانی را طراحی نماید. چهار مرحله بیماری عبارت است از : مرحله یI : سرطان تنها محدود به لایه های بالایی سلول های مخاط مری است. مرحله ی II : سرطان لایه های عمیق تر مخاط مری را در بر گرفته یا به عقده های لنفاوی مجاور مری انتشار پیدا کرده است. در این مرحله، سرطان به دیگر قسمت های بدن انتشار نمی یابد. مرحله ی III : سرطان بصورت عمیق داخل دیواره ی مری را مورد تهاجم قرار داده است و به بافت ها یا عقده های لنفاوی مجاور مری انتشار پیدا نموده است. سرطان هنوز به دیگر قسمت های بدن انتشار پیدا نکرده است. مرحله ی IV : سرطان به سایر قسمت های بدن انتشار یافته است. سرطان مری تقریبا در هر قسمتی از بدن بیمار مانند کبد، ریه ها، مغز و استخوان ها می تواند انتشار یابد. (فرقانی فرد، 2010) 1-1-2 عوامل خطر زا در ابتلا به سرطان مری این سرطان مانند دیگر سرطان ها حاصل مجموعه ای از عوامل محیطی و تغییرات ژنتیکی است . عامل های خطر در EACو ESCCبا هم متفاوت است ، به عنوان مثال عامل های محیطی و رژیم غذایی به شدت با ESCCدر ارتباط هستند اما رفلاکس ( جریان برگشتی )، معدی- مروی[8] مکرر و واکنش های التهابی پس از آن نقش بسیار مهمی در ابتلا به EACدارد . (ژو، 2009) دود تنباکو ، مصرف الکل ، سوء تغذیه ، کمبود سلنیوم ، کمبودی روی را می توان از عوامل محیطی مهم موثر نام برد. (کمانگر و همکاران، 2007) طبق مطالعات انجام شده توقف مصرف الکل و تنباکو خطر ابتلا به این سرطان را بسیار کاهش می دهد. (جاب و همکاران، 2009)[9] به نظر می رسد که ESCCهمراه با ویروس پاپیلومای انسانی [10] (HPV) معمولا در کشورهایی که خطر بالاتری برای ESCC دارنده رایج تر است . HPVویروسی است که علت اصلی سرطان گردن رحم محسوب می شود. مطالعات انجام شده در سال 2002 نشان داده است که DNA این ویروس در 2/15 درصد ESCC ها وجود دارد . ( حسین[11] و همکاران، 2009 : هررا [12]و همکاران، 2009) 1-1-3 تغییرات مولکولی در سرطان مری در ایجاد سرطان، عوامل مولکولی و ژنتیکی نیز می توانند دخیل باشند که در مورد سرطان مری این عوامل می تواند با توجه به نوع ان متفاوت باشد  1-1-3-1 تغییرات مولکولی در EAC رفلاکس معدی – مروی مزمن به عنوان مهم ترین عامل تاثیرگذار در ایجاد EACدر نظر گرفته می شود . افزایش خطاهای کروموزومی ، تغییرات ژنتیکی ویژه و ناهنجاری های اپی ژنتیکی ژن های سرکوب گر تومور ، مشخص کننده این بدخیمی می باشد . تغییرات دیگر شامل افزایش فعالیت تلومراز و تغییرات اپی ژنتیکی مانند متیله شدن مضاعف از دیگر عوامل مولکولی در EAC هستند . (جاب و همکاران، 2009) 1-1-3-2 تغییرات مولکولی در ESCC بر خلاف آدنوکارسینوم مری ، عامل های خطر و سازوکارهای متفاوت مولکولی در ایجاد ESCCنقش دارند. (جاب و همکاران، 2009) نمونه های مرسوم ژن های سرکوب گر تومور شامل Rb و P53است که مطالعات ، نقش جهش در این دو ژن را در مراحل آغازین ESCC نشان داده است . از دیگر عوامل، جهش در ژن BCL-2 که نقش ضد آپوپتوزی دارد، می توان نام برد. (جاب و همکاران، 2009; نوری دلوئی و یعقوبی، 1999) یکی از عامل های تاثیر گذار روی عملکرد ژن های سرکوب کننده تومور، ریزماهواره ها[13] هستند . تغییرات در این ریزماهواره ها می تواند سلول های طبیعی را به سلول های نامیرا و نئوبلاستی تبدیل کند . برخی از جایگاه های ریزماهواره ها و جایگاه های ژن های سرکوب کننده تومور در نزدیکی هم قرار گرفته اند که به نام نقاط داغ معروف هستند و در غیر فعال کردن ژن های سرکوب کننده تومور نقش دارند. (نوری دلوئی، 2009 ; ان[14] و همکاران، 2005) از دیگر عوامل می توان به تغییرات اپی ژنتیکی به ویژه متیله شدن بازهای ناحیه ی پروموتر ژن اشاره کرد که موجب غیر فعال شدن ژن های سرکوب کننده تومور و تنظیم چرخه ی سلولی می شود . (نوری دلوئی و شریفی، 2001) مطالعات مولکولی سرطان مری، ناهنجاری های ژنتیکی مانند دگرگونی در بیان ژن های p53،p16، سیکلین D1، E-Cadherin ، C-myc و ... را در EACو ESCC نشان داده است . در بسیاری از موارد دگرگونی های ژنتیکی معینی به طور مشترک در EACو ESCC مشاهده شده است . اما در برخی از موارد بیان مکرر و نابه جای ژن ها در یکی از انواع سرطان مری بیش از نوع دیگر ذکر شده است . بیان ژن های تغییر یافته اغلب با عامل های خطر سرطان مری ارتباط نزدیکی دارند. ( اکا[15] و همکاران، 2009 ; اینگراوالو[16] و همکاران، 2009) 1-1-4 درمان هایرایج سرطان مری درمان وقتی ارزشمند است که در مراحل اولیه بیماری باشد زیرا کمتر از 20 درصد بیماران بعد از 5 سال زنده می مانند. با اینکه پیش اگاهی سرطان مری در سه دهه اخیر به شکل ارامی بهبود یافته است اما هنوز میزان بقای 5 ساله بیماران بسیار پایین است. دلایل مختلفی را می توان مسبب ان دانست: - عدم کفایت روش های غربال گری بیماران - شناسایی سرطان در مرحله پیشرفته، به طوری که نیمی از بیماران در مرحله ی غیر قابل جراحی و متاستاز قرار دارند. - ریسک بالای عود بیماری بعد از جراحی و شیمی درمانی - عدم دسترسی به یک روش غیر تهاجمی قابل اطمینان - بقاء محدود در مورد بیماران غیر قابل جراحی و متاستاتیک شیمی درمانی شده به عنوان درمان تسکینی درمان سرطان مری بستگی به عواملی از قبیل اندازه، موقعیت و وسعت تومور و سلامتی عمومی بیمار دارد. بیماران اغلب توسط گروهی از پزشکان متخصص شامل متخصصین گوارش، انکولوژیست بالینی و انکولوژیست رادیوتراپی درمان می شوند. درمان سرطان، باعث تحریک دهان شده و خطر عفونت دهان را افزایش می دهد، لذا پزشکان اغلب به مبتلایان سرطان مری توصیه می کنند جهت معاینه ی دندان و درمان بیماری های ان، قبل از شروع درمان، به دندانپزشک مراجعه کنند. درمان های متفاوت و ترکیب های درمانی متعددی برای کنترل سرطان و یا بهبود کیفیت زندگی بیماران از طریق کاهش علایم و نشانه ها مورد استفاده قرار می گیرد. 1-1-4-1 جراحی شایع ترین درمان سرطان مری، جراحی است. معمولا جراح کل تومور یا قسمتی از مری و عقده های لنفاوی مجاور تومور و سایر بافت های ناحیه را بر میدارد. عمل برداشتن مری ازوفاگوستومی نام دارد. جراح قسمت های سالم باقی مانده مری را به معده وصل می کند. بنابر این بیمار باز هم قادر به عمل بلع می باشد. گاهی نیز از لوله های پلاستیکی یا بخشی از روده، جهت ارتباط بین مری و معده استفاده می گردد. همچنین ممکن است جراح، مجرای بین معده و روده ی باریک را پهن تر کند تا محتویات معده اسان تر به درون روده ی باریک وارد شود. جراحی تمام تومور تنها در 40 درصد بیماران امکان پذیر است و ممکن است سلول های توموری در حاشیه ناحیه ی تومور باقی بمانند. گاهی اوقات عمل جراحی بعد از اتمام سایر درمان ها انجام می گیرد. 1-1-4-2 رادیوتراپی رادیوتراپی استفاده از اشعه ی ایکس جهت از بین بردن سلول های توموری می باشد. رادیوتراپی فقط روی سلول های توموری تحت درمان موثر واقع می شود. پرتو ممکن است از دستگاهی در خارج از بدن (رادیوتراپی خارجی) و یا از مواد رادیواکتیوی که درون یا مجاور تومور قرار داده می شوند، خارج شود (رادیوتراپی داخلی). لوله ی پلاستیکی به درون مری وارد می شود تا در هنگام رادیوتراپی مری باز نگه داشته شود. رادیوتراپی ، بیمار را از عوارض جراحی مصون نگه می دارد مخصوصا اگر اندازه یا موقعیت تومور عمل جراحی را مشکل افرین نماید، اما غالبا اثر کمتری بر نشانه های انسدادی پیشرفت سرطان دارد و فقط می توان آن را به عنوان راه درمانی اولیه و سریع در نظر گرفت. رادیوتراپی می تواند به تنهایی یا همراه با شیمی درمانی به کار گرفته شود. پزشکان از رادیوتراپی به همراه شیمی درمانی برای کوچک کردن اندازه تومور قبل از جراحی استفاده می کنند. حتی اگر تومور را نتوان به وسیله ی جراحی خارج نمود و یا توسط رادیوتراپی بطور کامل از بین برد، رادیوتراپی اغلب به تسکین درد کمک کرده وعمل بلع را راحت تر می سازد. 1-1-4-3 شیمی درمانی از دیگر روش های درمانی، شیمی درمانی است. شیمی درمانی، کاربرد داروهای ضد سرطان برای از بین بردن سلولهای سرطانی است. داروهای شیمی درمانی مورد استفاده برای درمان سرطان مری در همه ی نقاط بدن پخش می شوند. این داروها به صورت تزریق داخل وریدی مورد استفاده قرار می گیرند. مطالعات نشان داده است که شیمی درمانی، باعث کاهش ابعاد تومور در 15 تا 20 درصد بیماران پس از معالجه ی تک دارویی و 30 تا 60 درصد بیماران بعد از معالجه ی چند دارویی همراه با رادیوتراپی شده است . شیمی درمانی همراه با پرتو درمانی به طور همزمان طول عمر بیمار را نسبت به افرادی که یکی از این روش ها استفاده کرده اند بیشتر می کند. 1-1-4-4 لیزر درمانی لیزر درمانی استفاده از نور با شدت بالا، برای از بین بردن سلول های سرطانی است. لیزر درمانی فقط سلول های ناحیه ی تحت درمان را تحت تاثیر قرار می دهد. پزشک ممکن است از لیزر درمانی برای از بین بردن بافت سرطانی و رفع انسداد مری، در صورتی که سرطان توسط جراحی از بین نرفته باشد، استفاده نماید. رفع انسداد مری به کاهش علایم بیماری، خصوصا مشکلات مربوط به بلع کمک می کند. 1-1-4-5 فتودینامیک نوعی لیزر درمانی است و شامل استفاده از داروهایی است که توسط سلول های سرطانی جذب می شوند. هنگامی که سلول های سرطانی در معرض نور خاصی قرار بگیرند، داروها فعال شده وسلول ها را از بین می برند. پزشک ممکن است از درمان فتودینامیک برای برطرف نمودن علائم سرطان مری مانند دشواری عمل بلع استفاده نماید. (فرقانی فرد، 2010) 1-2 پروتئین EpCAM مولکول چسبندگی سلول اپی تلیال (EpCAM)[17] که به نام آنتی ژن اختصاصی سلول اپی تلیال و CD326 نیز نامیده می شود یک گلیکوپروتئین بین غشایی با وزن مولکولی 40 کیلو دالتون است . این پروتئین دارای دو تکرار شبه فاکتور رشد اپیدرمال در دومین خارجی و یک دومین کوچک داخل سلولی حاوی دو جایگاه اتصال α- اکتین است . ( لیتوینوف[18] و همکاران، 1997-1994 ; بالزار[19] و همکاران، 1998) EpCAMدارای 314 آمینو اسید است که به 3 قسمت تقسیم می شود. یک دومین خارجی طولانی حاوی دومین شبه فاکتور رشد اپیدرمال و یک دومین تیروگلوبولین[20] ، یک ناحیه بین غشایی کوچک و یک دم داخل سلولی 26 اسید آمینه ای آن را تشکیل داده است . (وینتر[21]و همکاران، 2003 ; نوینک[22] و همکاران، 2006 ; بلونی[23] و همکاران، 2009) این پروتئین اولین بار در سال 1979 به عنوان یک آنتی ژن شناسایی شد . این پروتئین موجب القای تولید آنتی بادی های مشخصی در موش ایمیونیزه شده با سلول های سرطانی روده بزرگ انسانی می شود. (هرلین[24]و همکاران، 1979) نام ژن بیان کننده این گلیکوپروتئین (epcam1) است که در جایگاه کروموزومی 2p21 قرار گرفته است. ( بائورل[25] و گیرس[26]، 2007) اگر چه عملکرد چسبندگی و خاصیت اتصال بین سلولی آن در همان سال های نخستین کشف شده بود ، اما پتانسیل نقش سیگنالی آن در ایجاد سرطان اخیرا مورد توجه قرار گرفته است. (مولدنهاور[27]، 1987) مطالعات ایمیونوهیستوشیمیایی نشان داده است که بیان پروتئین EpCAMدر تومورهای بدخیم اپی تلیالی بسیار افزایش پیدا می کند. (شتی[28] و همکاران، 1988 ; دیازاریاس[29] و همکاران، 1993) این میزان افزایش بیان در مراحل مختلف پیشرفت سلول های سرطانی مثل پیش از بدخیمی،بدخیمی، بعد از شیمی درمانی، بعد از عود کردن مجدد و متاستاز مورد بررسی قرار گرفت و این مطالعات موجب شد که پروتئین EpCAMبه عنوان یکی از مارکرهای مولکولی جهت هدف های درمانی بیماران مبتلا به سرطان های مختلف دستگاه گوارش پیشنهاد شود. (استوپ[30] و همکاران، 1992 ; پروونچر[31] و همکاران، 1993 ; ماگویر[32] و همکاران، 1994 ; پسبوسک فارو[33] و همکاران، 2005) شکل1-2.بیان مختلف پروتئین EpCAMدر سلول نرمال و مراحل مختلف سرطانی شدن سلول سنگفرشی مری.A : سلول نرمال با بیان بسیار ضعیف. B: سلول توموری اولیه با بیان ضعیف و غیر یکنواخت. C: سلول توموری ثانویه با بیان قوی و غیر یکنواخت. D: سلول توموری نهایی با بیان قوی و یکنواخت. نواحی تیره نشان گر بیان بالاتر پروتئین EpCAMمی باشد. ( استوکلین و همکاران، 2006)[34] مطالعات انجام شده بر روی ساختار پروتئین EpCAMنشان دهنده آن است که این پروتئین در طی سنتز می تواند توسط آنزیم های مختلف برش خورده و قطعه پپتید سیگنالی آن حذف شده و در پروتئین نهایی که بر روی سطح سلول اپی تلیال ظاهر می شود وجود نداشته باشد . همچنین این پروتئین دارای سه جایگاه اتصال آنتی بادی است که دوتای آن به دومین خارج سلولی EpCAMاتصال می یابند و دیگری می تواند دم سیتوپلاسمی این پروتئین را جهت اتصال شناسایی کند. آنتی بادی مونوکلونال MOC31، موتیف خارج سلولی حد فاصل آمینواسیدهای 27 تا 59 را شناسایی کرده و دیگر آنتی بادی مونوکلونال 311-1K2ناحیه ی خارج سلولی حد فاصل آمینواسیدهای 143 تا 164 را شناسایی می کند . p6052که یک پلی کلونال آنتی بادی است هم ناحیه ی داخل سلول در دم سیتوپلاسمی پروتئین حد فاصل آمینو اسیدهای 301 تا 314 را شناسایی می کند. (شنل[35] و همکاران، 2013) در شکل 1-3 ، ساختار پروتئین EpCAMو جایگاه های شناسایی شونده توسط انتی بادی های اختصاصی ان نشان داده شده است. مطالعات اخیر نشان داده است که عملکرد پروتئین EpCAMتنها به خاصیت چسبندگی و اتصال آن خلاصه نمی شود بلکه می تواند در پیام رسانی سلولی، مهاجرت سلولی، تکثیر و تمایز سلولی نیز نقش ایفا کند. (ترزپیس[36] و همکاران، 2007 ; ماتزل[37] و همکاران، 2009) ارتباط پروتئین EpCAMبا تکثیر، چسبندگی، تثبیت بافت، تحریک رشد توموری و متاستاز موجب شد این پروتئین به عنوان یک مارکر جهت روش های درمانی در مقابله با سرطان پیشنهاد شود. (بائورل و گیرس، 2007) شکل 1-3. ساختار پروتیین EpCAMو اپی توپ های شناسایی شونده توسط انتی بادی های اختصاصی (شنل و همکاران، 2013) 1-3 مسأله ی تحقیق در این مطالعه ما در نظر داریم با طراحی، آنالیز بیوانفورماتیکی ، کلونینگ و بیان یک مولتی توپ اپی توپ های ایمنوژنیک پروتئین غشایی EpCAM، پتانسیل موجود برای بهبود روش های تشخیصی مثل تولید کیت های تشخیصی جهت تشخیص زودهنگام و پیش از بدخیم شدن سلول های سرطانی مری و همچنین گشایشی در تولید واکسن علیه سرطان مری را بررسی کنیم. در این مطالعه فرضیه های زیر مطرح شد. - اپی توپ های ایمنوژنیک EpCAM را می توان به صورت یک مولکول پلی توپ طراحی و آنالیز کرد. - مولکول طراحی شده از لحاظ فیزیکو شیمیایی پایدار است . - مولکول پلی توپ سنتز شده می تواند در میزبان مناسب کلون و بیان شود [1] -Esophageal cancer [2]-Esophageal Squamaus Cell Carcinoma [3]- Esophageal Adenocorcinoma [4] - Sampliner et al. [5]- Demeester [6]- Xu [7]-World Health Organization [8]- Gastro-Esophageal reflax [9]- Jobe et al. [10]- Human Papilloma Virus [11]- Hussain et al. [12]- Herrera et al. [13]- Micro satellites [14]- An et al. [15] - Oka et al. [16] - Ingravallo et al. [17]-Epithelial Cell Adhesion Molecule [18]- Litvinov et al. [19]- Balzar et al. [20]-Thyroglobulin [21]- Winter et al. [22]- Novinec et al. [23]- Bellone et al. [24]- Herlyn et al. [25]- Baeuerle [26]- Gires [27]- Moldenhauer [28]- Shetye et al. [29]- Diaz-Arias et al. [30]- Stoop et al. [31]- Provencher et al. [32]- Maguire et al. [33]- Passebosc-Faure et al. [34]- Stoecklein et al. [35]- Schnell et al. [36]- Trzpis et al. [37]- Maetzel et al. دریافت فایل طراحی، انالیز بیوانفورماتیکی، همسانه سازی و بیان مولتی توپ انتی ژن اختصاصی کارسینومای سلول های سنگفرشی مری